Einfluss der elektrochemischen Oxidation und der Wirkstoffbeladung auf die antibakteriellen Eigenschaften und die Zellbiokompatibilität von Titansubstraten

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 8595 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Eine Kombination aus \({\text{ TiO}}_{2}\) Nanotube Array (TON) und einem System zur kontrollierten Wirkstofffreisetzung wird eingesetzt, um verbesserte Oberflächeneigenschaften von Titanimplantaten bereitzustellen. Der elektrochemische Anodisierungsprozess wird verwendet, um TON für die Einführung von Vancomycin, einem wirksamen antibakteriellen Medikament gegen Staphylococcus aureus, zu erzeugen. Mit TON beladenes Vancomycin wird dann mithilfe der Schleuderbeschichtungstechnik mit mehreren Schichten 10 %iger Gelatine beschichtet. Der Gelatinefilm ist mit Graphenoxid (GO)-Nanopartikeln verstärkt, um die Oberflächenbioaktivität zu verbessern. Die Oberfläche der Proben wird durch Feldemissionselektronenmikroskopie (FESEM), energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDS) und Kontaktwinkelmessung charakterisiert. Die Ergebnisse veranschaulichen, dass die TON aufgebaut wurde und Vancomycin-Moleküle erfolgreich geladen wurden. Die Studie zur Arzneimittelfreisetzung zeigt, dass die Menge des freigesetzten Vancomycins durch die Dicke der Gelatineschichten gesteuert wird. Mit einer Erhöhung der Gelatinefilmschichten von 3 auf 7 verringerte sich die Freisetzung von Vancomycin in der Burst-Release-Phase von 58 auf 31 %, und die anhaltende Freisetzung verlängerte sich von 10 auf 17 Tage. Die Zugabe von GO-Nanopartikeln scheint die Arzneimittelfreisetzung um 31 bis 22 % (Burst-Release-Phase) zu reduzieren und die Arzneimittelfreisetzung (von 17 auf 19 Tage) zu verlängern. Der MTT-Assay weist darauf hin, dass die Proben keine Zytotoxizität aufweisen und dass die Kombination von GO-Nanopartikeln mit einer Gelatinebeschichtung die Proliferation von MG63-Zellen stark fördern könnte. Das Einweichen der Proben in SBF-Lösung nach 3 und 7 Tagen zeigt, dass Hydroxylapatitkristalle auf der TON-Oberfläche mit GO-Gelatine abgeschieden wurden und mehr als die TON-Oberfläche mit Gelatine überzogen. Basierend auf den Ergebnissen des Scheibendiffusionstests zeigen beide Proben (beladen mit Vancomycin und beschichtet mit Gelatine und Gelatine-GO) mit einer Hemmzone von 20 mm wirksame antibakterielle Eigenschaften gegen S. aureus. Die Beweise zeigen, dass mit Vancomycin beladene und mit Gelatine-GO beschichtete Titandioxid-Nanoröhren ein großes Potenzial für eine allgemeine Anwendbarkeit im Bereich orthopädischer Implantate haben.

Titan und seine Legierungen gehören zu den am häufigsten verwendeten metallischen Materialien im Bereich orthopädischer und zahnmedizinischer Implantate1,2,3. Wünschenswerte Eigenschaften wie Zugfestigkeit und Elastizitätsmodul, hohe Biokompatibilität und geringes Allergierisiko machen sie zu erfolgreichen Kandidaten für diese Anwendungen4,5,6. Allerdings weisen Implantate auf Ti-Basis einige Mängel auf, darunter schlechte Osteointegration, geringe Osteogenese und bakterielle Infektionen an der Implantatstelle, die insbesondere bei längerem Gebrauch zum Versagen des Implantats führen können7,8,9. Im Allgemeinen kommt es zu einer schlechten Osteointegration von Ti-basierten Implantaten aufgrund der bioinerten Oberfläche, der Produktion übermäßiger reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) an der Grenzfläche und einer bakteriellen Infektion nach der Operation10. Daher werden üblicherweise zwei Strategien zur Linderung dieser Probleme in Betracht gezogen, darunter die Steigerung der Osteoblastenzellproliferation und die Hemmung bakterieller Infektionen11,12.

Langfristige intravenöse oder orale Antibiotika sind die wichtigsten traditionellen Ansätze zur Behandlung bakterieller Infektionen nach einer Implantation13, die schwerwiegende Nachteile haben, darunter schädliche Nebenwirkungen, Toxizität, ungleichmäßige Bioverteilung und geringere Bioverfügbarkeit14,15. Staphylococcus aureus gilt als Hauptbakterium, das nach einer Operation eine Implantatinfektion verursacht16,17,18. Die Sekretion dieser Bakterien auf Implantatoberflächen bildet Biofilme, die sie vor dem Immunsystem und antibakteriellen Wirkstoffen schützen. Daher ist die Behandlung mit Antibiotika zu einem lebenswichtigen Thema geworden19. Da Bakterien und Osteoblastenzellen um die Anheftung konkurrieren, können Implantate mit antibakteriellen Oberflächeneigenschaften die Anheftung von Bakterien und die Koloniebildung verringern, sodass sie zur Behandlung von Knochendefekten eingesetzt werden können20,21. Fortschrittliche Biomaterialien, die mit einer anhaltenden und lokalen Freisetzung antibakterieller Wirkstoffe ausgestattet sind, könnten den Heilungs-/Regenerationsprozess von Geweben fördern, die anfälliger für bakterielle Infektionen sind (z. B. Knochen, Haut, Herzgewebe)22,23,24,25.

Durch die Konvergenz von Materialwissenschaft und Biologie kann eine Kombination aus Oberflächenmodifikation und Arzneimittelabgabesystemen eingesetzt werden, um die oben genannten Komplikationen zu bewältigen. Das elektrochemische Anodisieren ist ein weit verbreiteter Prozess unter den Oberflächenmodifikationen, der \({\text{TiO}}_{2} \) Nanoröhrenarrays (TON) auf Titansubstraten aufbaut26,27,28,29. TON-Arrays verfügen über vorteilhafte Eigenschaften, darunter die Aufnahme einer breiten Palette an Medikamenten und eine höhere Biokompatibilität aufgrund ihrer hochporösen Nanostrukturen. Darüber hinaus ist ihre Herstellung kostengünstig und einfach29,30,31,32,33. Der Hauptnachteil von TON-Arrays als Wirkstoff-Nanoreservoir ist das unkontrollierbare Freisetzungsverhalten des Wirkstoffs, das zu Toxizität an der Implantationsstelle führen kann. Modifiziertes TON, beispielsweise mit Biopolymeren beschichtetes TON, zeigt jedoch ein verbessertes Arzneimittelfreisetzungsverhalten34,35,36. Mit Biopolymeren beschichtetes TON kann eine bessere Kontrolle des Arzneimittelfreisetzungsverhaltens ermöglichen, indem ein Biopolymer basierend auf Zusammensetzung und Abbaugeschwindigkeitseigenschaften ausgewählt wird37. Darüber hinaus kann die Polymerbeschichtung von Natur aus osteointegrierende und antibakterielle Eigenschaften haben38,39,40 und sie können auch ein zweites Medikament als Multidrug-System tragen41,42,43,44,45.

Um in dieser Studie die Wirkstofffreisetzung zu verzögern und gleichzeitig die Bioaktivität von Titansubstraten zu erhöhen, wurde ein mehrschichtiges Nanokomposit-Hydrogel als Abdeckung auf der TON-Oberfläche verwendet. Unter den biokompatiblen Hydrogelen ist Gelatine mit FDA-Zulassung das wichtigste Biopolymer, das häufig in biomedizinischen Anwendungen verwendet wird, insbesondere in der Gewebezüchtung und Forschung zur Arzneimittelabgabe46. Laut Literatur und unseren bisherigen Erfahrungen bietet GO als hydrophiles Nanopartikel viele Vorteile in Kombination mit Hydrogelen als Nanokompositstruktur47,48. In der Zahn- und Knochengewebetechnik verbessern GO-Nanopartikel die Osseointegration/Osteoblastenbioaktivität durch Beschleunigung der Apatitbildung49. Darüber hinaus weisen Graphen und seine Derivate ein großes Potenzial für die osteogene Differenzierung von Stammzellen50 auf und wurden als Beschichtungsmittel für orthopädische Implantate vorgeschlagen51,52. Hier wollten wir Gelatine- und GO-Eigenschaften überlagern, um die TON-Oberfläche zu modifizieren, wobei die beschichtete Gelatine/GO-Mehrschichtstruktur die osteogenen Eigenschaften verbessert und gleichzeitig die Wirkstofffreisetzung aus dem Nanoröhrenreservoir verzögert.

Zu diesem Zweck wurden TON-Arrays durch einen Anodisierungsprozess auf der Oberfläche von Titansubstraten gebildet und Vancomycin, ein antibakterielles Medikament gegen S. aureus, wurde in Nanoröhren-Arrays eingebracht53,54. Graphenoxid-Gelatine-Nanokomposit wurde verwendet, um mit Vancomycin beladene TON-Arrays zu beschichten. Die modifizierten Titanproben wurden dann durch Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FESEM), energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX), Benetzbarkeitsmessung und Abbaubarkeit charakterisiert. Darüber hinaus wurde das Wirkstofffreisetzungsverhalten an Proben mit unterschiedlichen Beschichtungsschichten beurteilt. Die Auswirkung der Oberflächenmodifikation von Titanproben wurde auf das Wachstum von MG63-Zellen und die Bildung von Hydroxylapatitkristallen mittels MTT-Assay und Bioaktivitätstest bewertet. Schließlich wurde ein Scheibendiffusionsassay eingesetzt, um die antibakterielle Aktivität der Proben aufzuklären.

Das in dieser Studie verwendete kommerziell erhältliche Reintitan (CP-Ti-Klasse 2) wurde von McMaster Carr Company, Los Angeles, CA, USA, geliefert. Graphenoxid wurde vom Zentrallabor der Amirkabir-Universität, Iran, Teheran bezogen. Vancomycinhydrochlorid wurde vom Pharmaunternehmen Daana, Iran, Teheran, gekauft. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und Trypsin wurden von Gibco BRL (Frankreich) bezogen. Fetales Rinderserum (FBS), MTT, DMSO, PBS und Penicillin/Streptomycin (PS) wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Simulierte Körperflüssigkeit (SBF) wurde von APATECH, Iran, Yazd bereitgestellt. Weitere Chemikalien wurden von Merck, Deutschland, geliefert.

Hochgeordnete Titandioxid-Nanoröhren-Arrays wurden auf Titanscheiben mit 10 mm Durchmesser unter Verwendung eines elektrochemischen Anodisierungsverfahrens hergestellt. Die Proben wurden zunächst mit SiC-Schleifpapier (Körnung: P800, P1000, P1200 und P1500) geschliffen und anschließend 25 Minuten lang in 70 %igem Ethanol, Aceton und entionisiertem Wasser unter Verwendung eines Ultraschallbades gereinigt. Die Proben wurden vor der Anodisierung bei Umgebungstemperatur getrocknet. Für den Anodisierungsprozess wurden Edelstahl- und Titanscheiben mit glatten Oberflächen als Kathoden- bzw. Anodenelektroden verwendet. Die Zelle wurde an eine Gleichstromversorgung angeschlossen (PEQ-Labor, EV843, hergestellt in Belgien) und als Elektrolytlösung wurden Ethylenglykol, 38 Gew.-% Ammoniumfluorid und 2 Vol.-% entionisiertes Wasser verwendet. Verarbeitungsparameter wie Temperatur, Spannung und Zeit sind von Bedeutung Auswirkungen auf die Struktur von anodisiertem Titan. Der Anodisierungsprozess wurde bei Spannungen von 45, 60, 70 und 95 für 1,5 und 3 Stunden (Tabelle 1) bei einer kontrollierten Temperatur (4 °C) durchgeführt. Alle anodisierten Proben waren Eine Minute lang in Ethanol und Aceton mit Ultraschall gereinigt und mit entionisiertem Wasser gespült. Abschließend wurden die Proben bei Raumtemperatur getrocknet.

Das Vancomycin wurde durch Pipettieren und Trocknen in Titandioxid-Nanoröhren eingebracht. Es wurde eine 25-mg/ml-Lösung von Vancomycin in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) hergestellt und 10 µL der Arzneimittellösung auf Nanoröhrchen pipettiert. Die Proben wurden bei Lufttemperatur getrocknet und mit einem weichen Tuch gereinigt. Um die Medikamentenrückstände zu entfernen, wurden die Proben abschließend mit der PBS-Lösung gespült. Um die Wirksamkeit der Arzneimittelbeladung zu verbessern und die erforderliche Konzentration zu erreichen, wurde der Arzneimittelbeladungsprozess viermal wiederholt.

Gelatinebasierte Filme unterschiedlicher Dicke wurden mittels Schleuderbeschichtungsverfahren auf Titandioxid-Nanoröhrensubstrate aufgetragen. Eine 10 Gew.-%ige wässrige Gelatinelösung wurde hergestellt und 60 s lang mit einer Geschwindigkeit von 3800 U/min auf die Substrate aufgeschleudert. Die Dicke des Polymerfilms würde das verzögerte Freisetzungsverhalten des Arzneimittels beeinflussen. Daher wurden Proben mit unterschiedlichen Beschichtungsschichten hergestellt, um das gewünschte Arzneimittelfreisetzungsprofil zu erhalten. Um den Gelatinefilm zu modifizieren, wurde GO als Wirkstoff hinzugefügt. Für die GO/Gelatine-Kompositsynthese wurden GO-Nanopulver zunächst 30 Minuten lang in entionisiertem Wasser mit einem Ultraschallhomogenisator dispergiert. Anschließend wurde die Gelatinelösung 10 %-GO 0,5 % hergestellt und auf die Proben aufgeschleudert. Alle Proben wurden anschließend bei 25 °C mit 25 % Glutaraldehyd dampfbehandelt. Um überschüssiges Glutaraldehyd zu entfernen, wurden die Proben dann 5 Minuten lang in eine wässrige Glycinlösung (7,5 mg/ml) getaucht und bei Raumtemperatur getrocknet. Abschließend wurde zur Sterilisation der Proben 20 Minuten lang ultraviolette Strahlung eingesetzt. Tabelle 2 listet die Proben mit ihren Abkürzungen auf.

Mithilfe der Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FESEM) wurde die Morphologie von anodisierten und auf Gelatinebasis beschichteten Proben beobachtet. Nachdem die Proben mittels Sputter Coater (Emitech, K450X) mit einer ultradünnen Goldschicht beschichtet wurden, wurden Bilder bei einer Beschleunigungsspannung von 25 kV im Hochvakuummodus aufgenommen. Die Abmessungen der Titandioxid-Nanoröhren wurden mit der Digimizer-Software analysiert. Der zerstörungsfreie Ellipsometrietest (SENpro, SENtech, Deutschland) und die SEM-Analyse wurden durchgeführt, um die Dicke der Polymerbeschichtung zu messen. Zur Bestimmung der Elementtypen in den Proben (TON und TON-Van) wurde energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDS) eingesetzt, insbesondere um das Vorhandensein von Vancomycin zu verifizieren.

Zur Messung des statischen Kontaktwinkels und der Benetzbarkeit der Proben wurde die Technik des ruhenden Wassertropfens verwendet. Ein entionisierter Wassertropfen (0,5 µl) wurde zunächst mit einer Mikrospritze auf die Oberfläche der Proben aufgetragen. Anschließend wurden Bilder aufgenommen und der statische Kontaktwinkel mit CAG-20, Jikan Co., gemessen. Das Experiment maß den durchschnittlichen Kontaktwinkel an fünf verschiedenen Punkten in jeder Probe bei Umgebungstemperatur.

Die Abbaubarkeit der Beschichtung hat einen direkten Einfluss auf das Arzneimittelfreisetzungsverhalten der Proben. Der Abbau von Biopolymeren hängt von ihrer Zusammensetzung, Struktur, Ladung und Oberflächeneigenschaften ab. Im Allgemeinen ist die Messung des Gewichtsverlusts die gebräuchlichste Methode zur Untersuchung des Hydrogelabbaus. In dieser Studie wurde jedoch keine Messung des Gewichtsverlusts durchgeführt, da ein signifikanter Unterschied zwischen dem Beschichtungsgewicht und dem Titangewicht bestand. Daher wurde die Abbaubarkeit durch Vergleich der REM-Bilder der Beschichtung vor und nach der Arzneimittelfreisetzung in PBS-Lösung bewertet. Die Proben wurden in saubere und sterile Glasflaschen mit PBS gegeben. Anschließend wurden sie versiegelt und in einen Inkubator (GFL, Deutschland) bei 37 °C und einer Geschwindigkeit von 60 U/min gestellt. Der Abbau wurde nach 10 und 17 Tagen gemessen. Schließlich wurde eine Gefriertrocknung durchgeführt, um das von den Hydrogelbeschichtungen absorbierte Wasser zu entfernen.

Die In-vitro-Freisetzung von Vancomycin aus reinen TON-, Gelatine-beschichteten und Gelatine-GO-beschichteten Proben, die mit dem Arzneimittel beladen waren, wurde durch Eintauchen in 10 ml PBS (pH = 7,4) bei 37 °C untersucht. Während der ersten 6 Stunden wurden in kurzen Abständen 300 µL des Mediums entnommen, um die stoßartige Freisetzung des Arzneimittels zu überwachen. Zur verzögerten Freisetzung des Arzneimittels wurden alle 24 Stunden 300 µL PBS-Lösung gesammelt, bis das gesamte Arzneimittel in das Medium freigesetzt war. Die Kalibrierungskurve wurde basierend auf Vancomycin in PBS erstellt, die Freisetzung des Arzneimittels wurde durch UV-Spektroskopie (Lambda 900, PerkinElmer, USA) bei 280 nm gemessen. Die Freisetzung galt als abgeschlossen, wenn sich die Absorption bei 280 nm nicht änderte. Die Daten wurden mittels mathematischer kinetischer Modellierung analysiert.

Für Zellkulturexperimente wurde die Osteosarkom-Zelllinie Human Osteoblast-Like Cells (HOS) MG-63 der National Cell Bank of Iran (NCBI; Pasteur Institute) verwendet. Die Zellen wurden in einem Kulturmedium (DMEM ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin) bei 37 °C im befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 kultiviert. Nachdem die Kultur eine Konfluenz von etwa 90 % erreicht hatte, wurden MG-63-Zellen durch Trypsinisierung und Zentrifugieren (1500 U/min, 5 Minuten) aus den Kulturflaschen entfernt. Anschließend wurden sie im frischen Medium suspendiert.

Proben einschließlich TON, TON-Van-Gel C7, TON-Van-Gel-GO und Kulturplatte als Kontrolle wurden durch UV sterilisiert und mit PBS und Kulturmedium gewaschen, bevor sie in eine Platte mit 24 Vertiefungen gegeben wurden. Anschließend wurden 200 µL Kulturmedium mit 80.000 Zellen auf die Oberfläche der Proben gesät. Nach 3-stündiger Inkubation wurde 1 ml Kulturmedium in jede Vertiefung gegeben. Anschließend wurde nach 1, 3 und 7 Tagen Inkubation das Kulturmedium entfernt, um die nicht anhaftenden Zellen zu entfernen, und die Proben wurden zweimal mit sterilem PBS gespült und mit frischem Kulturmedium, ergänzt mit 1 mg/ml MTT-Lösung, 4 Stunden lang inkubiert ermöglichen die Bildung von Formazan. Nach dem Entfernen des Mediums wurden 50 µL Dimethylsulfoxid (DMSO)-Lösung in jede Vertiefung gegeben und 10 Minuten lang inkubiert, um die Formazankristalle aufzulösen. Das Medium wurde auf eine 96-Well-Platte übertragen, um die Absorption der resultierenden violetten Lösung mit einem Mikroplatten-Lesegerät bei 580 nm zu messen. Die Lebensfähigkeit der Zellen hängt direkt von der Menge an Formazankristallen ab, die durch Division der durchschnittlichen optischen Dichte der Proben durch die durchschnittliche optische Dichte der Kontrolle berechnet wird.

Proben (TON-Van-Gel und TON-Van-Gel-Go) wurden durch Einweichen in 5 ml SBF-Lösung ähnlich menschlichem Blutplasma bewertet. Die Proben wurden 3 und 7 Tage lang bei 37 °C aufbewahrt. Das Medium wurde alle 2 Tage ausgetauscht, um eine unzureichende Anwesenheit von Ionen (Ca und P) zu vermeiden. Die Proben wurden aus der SBF-Lösung entnommen und mittels Gefriertrocknung getrocknet. Die Struktur und Morphologie der in SBF eingetauchten Proben wurden durch FESEM charakterisiert.

Zur Untersuchung der antibakteriellen Eigenschaften der Proben wurde ein Hemmzonentest, auch Kirby-Bauer-Test genannt, eingesetzt. Es wurde grampositiver S. aureus (ATCC 25923) eingesetzt, einer der infektiösesten Bakterien im Knochengewebe-Engineering. Platten mit Mueller-Hinton-Agarmedium (Merck, Deutschland) wurden mit S. aureus in einer Konzentration von 1,5 × 108 KBE/ml bestrichen. Anschließend wurden die Proben (TON-Van-Gel-GO und TON-Van-Gel C7) vorsichtig in den Agar-Nährstoff gegeben. Als Positivkontrolle wurden Ciprofloxacin-Antibiotikascheiben auf die Platten gelegt. Abschließend wurden die Platten 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, damit die Bakterien im Agarmedium wachsen konnten. Die Größe der Hemmzone, die um die Scheiben herum erschien, zeigt die antibakterielle Aktivität jeder Probe an.

Die statistische Analyse wurde mit der SPSS-Software (Version 17.0; IBM New York, NY, USA) durchgeführt. Wenn statistische Unterschiede festgestellt wurden, wurde ein T-Student-Vergleichstest durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD bei einem Signifikanzniveau von p < 0,05 angegeben.

In jüngster Zeit wurde der elektrochemischen Anodisierung zum Aufbau selbstgeordneter Titandioxid-Nanoröhrenstrukturen mehr Aufmerksamkeit gewidmet. Stark haftende Nanoröhrenstrukturen mit offenen Oberseiten und geschlossenen Enden sind die günstigsten Nanoträgersysteme für Arzneimittel. Die Parameter wie Spannung und Zeit des Anodisierungsprozesses haben den größten Einfluss auf die Morphologie von Titandioxid. Hier wurde der Einfluss von Anodisierungsparametern auf die Morphologie von Titandioxid untersucht, die für die daraus resultierende Arzneimittelbeladung von großer Bedeutung ist. Der Anodisierungsprozess wurde mit unterschiedlichen Spannungen (45, 60, 70, 90 V) und verschiedenen Zeiten (1,5, 3 h) durchgeführt. Die Experimente wurden im Elektrolyten mit Ammoniumfluorid bei kontrollierter Temperatur (4 °C) durchgeführt. Die erste Reaktion der anodischen Oxidation war die Elektrolyse von Wasser (Reaktion 1). Anschließend bildete sich auf den Titansubstraten eine kompakte Schicht aus Titandioxid (Reaktion 2), die anschließend durch Fluoridionen aufgelöst wurde. Als Ergebnis bildeten sich Vertiefungen auf den Titanoberflächen (Reaktion 3). Bei geeigneter Spannung und Zeit wurden die Vertiefungen in Nanoröhrenstrukturen umgewandelt. Bei der niedrigsten angelegten Spannung (45 V) bildeten sich auf den Ti-Oberflächen Vertiefungen mit verschwindend kleinem Durchmesser, die Morphologie der Nanoröhren war jedoch nicht erkennbar (Abb. 1a). Als die Spannung auf 60 V erhöht wurde, bildeten sich Titandioxid-Nanoröhren, die jedoch nicht hochgeordnet waren (Abb. 1b). Bei einer Spannung von 70 V zeigten die Nanoröhren eine besser unterscheidbare Morphologie mit vergrößertem Durchmesser (Abb. 1c).

REM-Bilder von Proben nach dem Anodisierungsprozess mit unterschiedlichen Spannungen und Zeiten (a) 45 V für 1,5 h, (b) 60 V für 1,5 h, (c) 70 V für 1,5 h, (d) 45 V für 3 h, (z ) 60 V für 3 h, (f) 70 V für 3 h, (g) 90 V für 3, (h) geöffnete Oberseite und (i) geschlossene Unterseite des TON-Arrays, hergestellt durch Anodisierungsprozess mit einer Spannung von 70 V und 3 h .

Mit zunehmender Anodisierungszeit von 1,5 auf 3 Stunden wurden bei niedriger Spannung (45 V) keine signifikanten Veränderungen in der Nanoröhrenstruktur beobachtet (Abb. 1d). Bei der höheren Spannung führte die Verlängerung der Anodisierungszeit jedoch dazu, dass die Nanoröhren intrinsischere Strukturen lieferten (Abb. 1e, f). Durch Erhöhen der Spannung auf 90 V wurde der obere Teil der Nanoröhren allmählich zerstört (Abb. 1g).

Eine wünschenswertere Morphologie der Nanoröhren wurde bei einer Anodisierungsspannung von 70 für 3 Stunden erhalten, wobei die REM-Bilder zeigten, dass sie einen Durchmesser von etwa 94 ± 4 nm und eine Länge von etwa 3 µm besitzen, vertikal ausgerichtet und hochgeordnet mit geöffneter Oberseite und geschlossenem Boden (Abb. 1h,i).

EDS wurde verwendet, um zu beweisen, dass Vancomycin in Titandioxid-Nanoröhren-Arrays geladen war. Die chemischen Zusammensetzungen der Proben (TON und TON-Van) wurden ermittelt, wie in Abb. 2a, b dargestellt. In beiden Proben waren Ti- und O-Elemente zu sehen, was die Bildung von \({\text{TiO}}_{2}\) auf der Oberfläche von Titanproben bestätigt. Das Vorhandensein von Cl, N und C im EDS-Spektrum von TON-Van (Abb. 2a) weist darauf hin, dass Vancomycin (C66H75Cl2N9O24) erfolgreich in die Nanoröhren-Arrays geladen wurde.

EDS-Spektrum von (a) TON, (b) TON-Van.

Stromtransientenkurven zeigen das Verhalten des Stroms gegenüber der Zeit während des Anodisierungsprozesses. Diese Kurve kann helfen, die Bildung der Titandioxidstruktur während des Prozesses zu erklären. Abbildung 3 zeigt die aktuelle Übergangskurve bei einer Spannung von 70 V für 3 Stunden und einer Temperatur von 4 °C. Das Anlegen der Anfangsspannung zeigte einen starken Anstieg bis zu einem Wert, der auf die Elektrolyse von Wasser und den Beginn der Bildung der kompakten Oxidschicht zurückzuführen ist. Die beobachtete Gasentwicklung in der Anodenzelle scheint mit der Übertragung elektrischer Ladung zusammenzuhängen und weist auf die elektrische Leitfähigkeit der Titanoberflächen hin. Anschließend nimmt der Strom aufgrund der Bildung einer dichten und kompakten Oxidschicht mit geringer elektrischer Leitfähigkeit stark ab. Mit abnehmender elektrischer Ladungsübertragung nahm der Ionentransport im Elektrolyten zu. Im nächsten Schritt wurde die kompakte Schicht durch Fluoridionen aufgelöst und Poren in der dichten Schicht bildeten Keime, was zu einem leichten Anstieg des Stroms und anschließendem Abfall führte. Aufgrund des schnellen Ionentransports (insbesondere Fluoridionen) und der schnellen Auflösung der Oxidschicht wurde hier jedoch kein geringer Stromanstieg beobachtet. Der andere Grund könnte die begrenzte zeitliche Auflösung unseres Messgeräts zur Aufzeichnung der schnellen Stromänderungen sein. Der Stromabfall würde allmählich ein Plateau erreichen. Es gab einen Wettbewerb zwischen Oxidation und Auflösung der Oxidschicht, die den Anodisierungsprozess steuert. Während der Anodisierung bildeten sich auf der kompakten Oxidschicht Nanoröhren. Wie in Abb. 3 zu sehen ist, steigt der Strom mit zunehmender Spannung auf höhere Werte an. Dies ist auf den erhöhten Elektronenaustausch während des Anodisierungsprozesses zurückzuführen. Mit zunehmender Spannung des Anodisierungsprozesses verbessert sich die Oxidationsrate und der Elektronenaustausch sowie die Stromdichte nehmen zu.

Transientenkurve bei Spannungen von 45, 70 und 90 V für 3 Stunden (4 °C).

Die Oberflächenhydrophilie oder Benetzbarkeit von Implantaten hat einen erheblichen Einfluss auf das Zellverhalten. Darüber hinaus verbessert sich auch die Beladungseffizienz des wasserlöslichen Wirkstoffs mit zunehmender Benetzbarkeit. Daher ist die Messung des Kontaktwinkels, die wichtigste Methode zur Untersuchung des Affinitätsgrads zwischen Wasser und den Oberflächen, für die Charakterisierung der Oberflächen von Implantaten zur Arzneimittelabgabe von entscheidender Bedeutung. Hier wurde die Benetzbarkeit von Proben (TON, TON-Gel C7 und TON-Gel-GO) untersucht und in Tabelle 3 dargestellt. Das TON war aufgrund des Eindringens von Wasser in die Nanoröhren hydrophil. Der Kontaktwinkel von TON-Van-Gel C7 und TON-Gel-Go betrug 71,9° bzw. 70,2°, was in einem ähnlichen hydrophilen Bereich liegt (kleiner als 90°) (Abb. 4a,b). Der ähnliche Kontaktwinkel weist darauf hin, dass der Kontaktwinkel selbst durch die Modifizierung von Gelatine mit Graphenoxid als hydrophilem Mittel unverändert blieb. Dies könnte teilweise auf Graphenoxid-Nanopartikel zurückzuführen sein, die die Mikroporen zwischen den Gelatinemolekülen füllen und blockieren. Die Mikroporenstruktur bietet Kanäle für das Eindringen und die Absorption von Wassermolekülen. Dies könnte auch mit der starken Vernetzung zwischen den Polymerketten zusammenhängen, die die Wasseraufnahme verhindert.

Wasserkontaktwinkelmessungen von (a) TON-Gel, (b) TON-Gel-GO.

Der Abbau der Beschichtung ist ein wichtiger Faktor für das Arzneimittelfreisetzungsverhalten. Daher wurde der In-vitro-Abbau von TON-Van-Gel C7 bewertet. FESEM wurde verwendet, um die Veränderungen in der mikroskopischen Morphologie der Gelatinebeschichtung während des Abbauprozesses in PBS zu beobachten. Abbildung 5a zeigt die dichte Struktur der Gelatinebeschichtung mit einigen Rissen vor dem Abbau. Diese Risse sind wahrscheinlich auf den Prozess der Gefriertrocknung zurückzuführen. In den Abbildungen 5b und c sind nach 10 und 17 Tagen keine Löcher und Kollabierungen in den Oberflächenbeschichtungen zu sehen, was auf eine dichte Struktur der Beschichtung hindeutet, die möglicherweise auf die starke Vernetzung zwischen den Polymerketten zurückzuführen ist.

REM-Bilder von TON-Van-Gel C7, eingeweicht in PBS und gefriergetrocknet (a) vor der Wirkstofffreisetzung, (b) nach 10 Tagen und (c) nach 17 Tagen.

Der Einfluss der Gelatinedicke auf die Freisetzung von Vancomycin wurde anhand von TON-Van, TON-Van-Gel C3 und TON-Van-Gel C7 untersucht. Die Dicke von 3 und 7 Gelatineschichten betrug 445 nm und 1038,06 nm, ermittelt durch Ellipsometrie. Wie in Abb. 6a, b zu sehen ist, wurden die Ellipsometrieergebnisse durch die REM-Querschnittsbilder bestätigt. Abbildung 7a zeigt die Vancomycin-Kalibrierungskurve (in PBS, bei 280 nm), die zur Ermittlung der Vancomycin-Konzentrationen verwendet wurde. Die in Titandioxid-Nanoröhren geladene Gesamtmenge an Vancomycin wurde mit einem UV-Vis-Spektrophotometer zu 490 µg/cm2 gemessen. Abbildung 7b zeigt ein vergleichendes Wirkstofffreisetzungsprofil von Vancomycin aus TON-Van, TON-Van-Gel C3 und C7. Wie erwartet zeigte das Freisetzungsverhalten von Vancomycin aus allen Proben ein zweiphasiges Verhalten, einschließlich einer stoßartigen Freisetzung und einer anhaltenden Freisetzung. Arzneimittelmoleküle im oberen Teil der Nanoröhren wurden im Anfangsstadium (Burst-Release-Phase) sofort in das Medium freigesetzt, wodurch die bakterielle Invasion gehemmt und die antibakterielle Wirksamkeit in den ersten Stunden der Implantation verbessert wurde. Das Wirkstofffreisetzungsprofil der Proben ist in Tabelle 4 aufgeführt. In der Burst-Freisetzungsphase betrug das aus TON-Van freigesetzte Vancomycin in der ersten Stunde etwa 83 %, während der aus TON-Van-Gel C3 und C7 freigesetzte Wirkstoff 58 % betrug 31 % bzw. In der Phase der verzögerten Freisetzung wurde das Arzneimittel aus TON-Van, TON-Van-Gel C3 und C7 in 1, 10 bzw. 17 Tagen freigesetzt. Die langsamere Freisetzung von Vancomycin aus TON-Van im zweiten Stadium zeigt, dass die Nanoröhrenstruktur als Nanoreservoir für das Medikament fungieren könnte. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass die Gelatinebeschichtung die Menge des freigesetzten Arzneimittels in der Burst-Release-Phase reduzierte. Mit zunehmender Anzahl der Schichten schleuderbeschichteter Gelatine nahm die Dicke zu, was zu einer deutlichen Verringerung der Arzneimittelfreisetzungsrate führte. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass die Polymerketten die Bewegung von Arzneimittelmolekülen einschränken und deren Freisetzung begrenzen könnten. Die Begrenzung der Arzneimittelfreisetzungsrate würde die Zeit verlängern, was eine bessere Kontrolle des Arzneimittelfreisetzungsprofils ermöglicht und die antibakterielle Eigenschaft der Proben verbessert.

Querschnitts-REM-Bilder der Gelatinebeschichtung (a) 3 Schichten und (b) 7 Schichten.

(a) Kalibrierungskurve von Reihenverdünnungen von Vancomycin in PBS, (b) Vancomycin-Freisetzungsprofil aus verschiedenen Schichten der Gelatinebeschichtung, (c) Vancomycin-Freisetzungsprofil aus der Gelatine-GO-Beschichtung und (d) Konzentration des freigesetzten Arzneimittels aus TON-Gel- GEHEN.

Die Wirkung von Graphenoxid auf das Freisetzungsprofil von Vancomycin wurde mit TON-Van-Gel-GO untersucht. Wie in Abb. 7c zu sehen ist, wurde ein zweiphasiges Verhalten für die GO-Gelatineprobe festgestellt. Der Prozentsatz der Arzneimittelfreisetzung wurde in der Burst-Release-Stufe durch Zugabe der GO-Nanopartikel von 31 auf 22 % gesenkt (Tabelle 4). Die negative Ladung von Graphenoxid und Carboxylgruppen könnte elektrostatisch mit Gelatineketten interagieren. Daher erschweren die physikalischen Verbindungen zwischen den Gelatineketten die Freisetzung von Vancomycin-Molekülen in PBS, was zu einer verlängerten Freisetzungsdauer führt. Tatsächlich könnte die GO-Gelatine-Beschichtung die Freisetzung von Vancomycin um bis zu 19 Tage verlängern. Im Vergleich dazu könnten die mit GO-Gelatine beschichteten Proben im Vergleich zu TON-Van- und TON-Van-Gel C7-Proben eine längere und anhaltende Arzneimittelfreisetzung ermöglichen, die für eine erfolgreiche Knochentherapie gegen Infektionen erforderlich ist.

Um über ein wirksames lokales Arzneimittelabgabesystem zu verfügen, sollte die Konzentration der antibakteriellen Arzneimittelfreisetzung in den Medien unter dem toxischen Wert und über der minimalen Hemmkonzentration (MHK) liegen. Hier zeigte Vancomycin bei 800 µg/ml kein toxisches Verhalten für MG-63-Zellen. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Vancomycin eine MHK von 0,5–10 µg/ml für S. aureus aufweist55,56,57,58,59. Wie in Abb. 7d gezeigt, lag die Vancomycin-Konzentration für TON-Van-Gel-GO in den Medien innerhalb des therapeutischen Fensters. Dies könnte bedeuten, dass das Arzneimittelabgabesystem in der Lage sein sollte, die Bakterien abzutöten und die Bildung von Biofilmen zu verhindern, ohne den zellulären Prozess zu beeinträchtigen.

Mathematische Modellierung wurde verwendet, um den Mechanismus der Arzneimittelfreisetzung zu untersuchen und die Freisetzungskinetik zu analysieren. Modellabhängige Methoden, die auf verschiedenen mathematischen Funktionen basieren, wurden eingesetzt, um die beste Anpassung für das Vancomycin-Freisetzungsprofil mit einem höheren Wert auszuwählen. Tabelle 5 fasst die Gleichung der mathematischen Funktionen zusammen, die zur Anpassung der Daten der Freisetzungsexperimente verwendet werden, einschließlich nullter Ordnung, erster Ordnung, Higuchi und Hixson-Crowell. Die erhaltenen \({\text{R}}^{2}\)-Werte für die Proben (TON-Van, TON-Van-Gel C7 und TON-Van-Gel-GO) sind in Tabelle 6 aufgeführt. Der Vergleich zwischen den \({\text{R}}^{2}\)-Werten ergab, dass die Vancomycin-Freisetzung in allen Proben perfekt mit dem Modell erster Ordnung übereinstimmte. Dies ist ein Hinweis auf die Freisetzung wasserlöslicher Arzneimittel aus einer porösen Matrix oder einer Matrix mit diffusionskontrolliertem Freisetzungssystem.

Die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen auf der Oberfläche der Proben wurde mittels MTT-Assay bewertet. Abbildung 8 zeigt die MG-63-Zellproliferation nach 1, 3 und 7 Tagen Kultur. Wie man sieht, wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen TON ohne Beschichtung und der Kontrollprobe beobachtet. Darüber hinaus war die Anzahl lebensfähiger Zellen auf der Oberfläche von TON-Van nach dem ersten Tag deutlich geringer als bei der Kontrolle. Die auf Gelatine basierende Beschichtung verbesserte nachweislich die Lebensfähigkeit der Zellen deutlich und die Zugabe von GO-Nanopartikeln hatte einen positiven Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen die Beispiele. Es ist bekannt, dass Gelatine den Zellen eine biomimetische Knochenumgebung bieten könnte, da sie das Hauptprotein der extrazellulären Matrix ist. Gelatine verfügt über die Arginin-Glycin-Asparaginsäure-Sequenz (RGD), die dafür bekannt ist, Zell-Substrat-Wechselwirkungen herzustellen. Darüber hinaus erhöht die Dispersion von GO-Nanopartikeln in Gelatine aufgrund der Vergrößerung der Oberfläche und der Zunahme der Oberflächenrauheit die Chance, mehr Zellnischen für Osteoblastenzellen zu schaffen. Es ist bekannt, dass die sauerstoffhaltigen funktionellen Gruppen an der Oberfläche die Adsorption der umgebenden Serumproteine ​​an der Oberfläche auslösen. Dies könnte der Grund dafür sein, dass GO-angereicherte Oberflächen die exogenen Proteine ​​absorbieren würden, was zu effizienten Wechselwirkungen mit den Zellen führt51. Es wird gezeigt, dass das Vorhandensein von GO-Nanopartikeln das Genexpressionsprofil beeinflussen und die mRNA-Expressionsniveaus aller osteogenen Marker hochregulieren könnte60,61.

Zelllebensfähigkeit von MG-63-Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten auf TON-Van, TON-Van-Gel, TON-Van-Gel-GO kultiviert wurden, unter Verwendung des MTT-Assays. (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 3).

Darüber hinaus könnten GO-Nanoblätter die Apatit-Keimbildung und die Bildung von Hydroxylapatit (HA) beeinträchtigen. Es wird von Wang et al. gezeigt. Dies könnte auf Ionenwechselwirkungen zurückzuführen sein. Die –OH- ​​und Carboxylgruppen von GO könnten Ca2+ und HPO4 2- der Mikroumgebungslösung anziehen, was zu einer beschleunigten Hydroxylapatitbildung führt50.

Die TON-Van-Gel-GO-Probe zeigte die besten Zellsubstratinteraktionen mit MG-63-Zellen. Hier zeigte Vancomycin bei 800 µg/ml eine Zelllebensfähigkeit von etwa 80 % am Tag 1. Daher zeigen die Ergebnisse keine Zytotoxizität, weder bei den Proben noch bei der Dosierung des verwendeten Arzneimittels gemäß ISO-10993-5.

Frühere Studien haben gezeigt, dass sowohl reine Titan- als auch TON-Oberflächen bioinert sind62,63,64. FESEM wurde verwendet, um die Bildung von knochenähnlichem Apatit auf den Proben (Gelatine und Gelatine-GO) zu bestimmen, die 3 und 7 Tage lang in SBF-Lösung eingeweicht wurden. Wie in Abb. 9a gezeigt, bildeten sich nach 3 Tagen einige Apatitkeime auf der Oberfläche der mit Gelatine beschichteten Probe, während die mit GO-Gelatine beschichtete Probe mit flockenartigem Apatit bedeckt war (Abb. 9b). Die negative Ladung von GO mit der Deprotonierung von –COOH- und –OH-Gruppen könnte \({\text{Ca}}^{2 + }\)-Ionen anziehen und die Apatit-Keimbildung verstärken50. Nach 7 Tagen Eintauchen in SBF war die Menge an Apatitkristallen auf beiden Proben erhöht (Abb. 9c, d). Allerdings war die Mineralisierung auf der Oberfläche der mit GO verstärkten Probe höher als bei der Probe ohne GO, was darauf hindeutet, dass die mit Gelatine beschichtete und mit GO verstärkte Probe die höchste Bioaktivität unter den Proben aufweist. Die Aminogruppen in Gelatine können Calciumionen anziehen, gefolgt von \({\text{PO}}_{4}^{3 - }\), was zu einem beschleunigten Biomineralisierungsprozess führen könnte. GO fördert auch die flockenartige Hydroxylapatit-Ablagerung durch elektrostatische Wechselwirkung. Es ist davon auszugehen, dass die TON-Van-Gel-GO-Probe eine stabilere Verbindung zwischen der Oberfläche der Proben und dem Knochengewebe herstellen könnte.

REM-Bilder von TON, beschichtet mit Gelatine, mit und ohne GO, Einweichen in SBF-Lösung für unterschiedliche Zeiten (a) TON-Gel für 3 Tage, (b) TON-Gel-GO für 3 Tage, (c) TON-Gel für 7 Tage und (d) TON-Gel-GO für 7 Tage.

Die antibakteriellen Eigenschaften der Proben wurden durch einen Scheibendiffusionstest nach 24-stündiger Inkubation gegen grampositive S. aureus-Bakterien, die häufigsten pathogenen Bakterien bei Knocheninfektionen, untersucht. Abbildung 10 zeigt die Hemmzonen der Proben einschließlich TON-Van-Gel und TON-Van-Gel-GO. Die Durchmesser der Hemmzonen wurden ebenfalls gemessen und in Tabelle 7 dargestellt, was unsere Beobachtung bestätigt. Die Hemmzonen beider Proben betrugen etwa 20 mm, was darauf hindeutet, dass beide Proben Vancomycin-Abgabemodelle bieten, die eine S. aureus-Infektion hemmen können. Es ist offensichtlich, dass Vancomycin eine wirksame antibakterielle Eigenschaft gegen grampositive Bakterien wie S. aureus bei minimaler Zytotoxizität bieten könnte. Diese Daten stimmten mit den Erkenntnissen von Liu et al.65 überein, die bestätigten, dass Vancomycin durch die anhaltende, durch Nanopartikel vermittelte Abgabe von der Titanoberfläche eine ähnliche Hemmzone bereitstellte und eine wirksame antibakterielle Wirkung gegen S. aureus zeigte. Das richtige Muster der Arzneimittelfreisetzung ist für die wirksame antibakterielle Wirkung der Implantatoberfläche von entscheidender Bedeutung. Wie in Abschnitt 3.6 erläutert, erreichte in dieser Studie die Konzentration des aus der Beschichtung freigesetzten Vancomycins in der ersten Stunde, in der die Wahrscheinlichkeit einer Infektion höher ist, die Konzentration über der MHK. Basierend auf der Studie von Zhang et al.66, in der eine elektrogesponnene, mit Vancomycin beladene Beschichtung auf einem Titansubstrat entwickelt wurde, könnten das erhaltene Freisetzungsprofil und die Konzentration des freigesetzten Vancomycins während 19 Tagen die Behandlung implantatassoziierter Infektionen in vivo unterstützen.

Scheibendiffusionstest zur Bewertung der antibakteriellen Eigenschaft von (a) TON-Van-Gel C7 und (b) TON-Van-Gel-GO.

In der vorliegenden Studie wurde eine Schicht aus \({\text{TiO}}_{2}\)-Nanoröhren auf reinen Titanproben durch elektrochemische Anodisierung hergestellt, um das Vancomycin als antibakterielles Mittel zu tragen. Eine mit Graphenoxid verstärkte Beschichtung auf Gelatinebasis wurde auf die Oberfläche der Proben aufgeschleudert, um das Freisetzungsprofil zu steuern und gleichzeitig die biologische Aktivität der Proben zu verbessern. Die reichliche Bildung von Apatitkristallen auf dem Gelatin-GO-Substrat deutet darauf hin, dass TON-Van-Gel-GO eine überlegene Bioaktivität und möglicherweise eine verbesserte Osteointegration aufweist. Da das TON-Van-Gel-GO auch wirksame antibakterielle Eigenschaften gegen grampositive S. aureus zeigte, wird davon ausgegangen, dass es ein vielversprechendes Potenzial für Anwendungen im Knochengewebe-Engineering darstellen könnte.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Dr. Shahsanam Abbasi für die technische Unterstützung während dieser Arbeit.

Abteilung für Biomedizintechnik, Technische Universität Amirkabir, Teheran, 15875/4413, Iran

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Stammzellen- und Regenerative Medizingruppe, Nationales Institut für Gentechnik und Biotechnologie (NIGEB), Teheran, 14965/161, Iran

Shahab Faghi

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FN entwarf die Experimente, führte die Analyse durch und verfasste den ersten Entwurf des Papiers. SF und RI koordinierten die Studie. SF hat auch den endgültigen Entwurf des Papiers verfasst. Alle Autoren überprüften die Ergebnisse und genehmigten die endgültige Version des Manuskripts.

Korrespondenz mit Rana Imani oder Shahab Faghihi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Nowruzi, F., Imani, R. & Faghihi, S. Einfluss der elektrochemischen Oxidation und der Wirkstoffbeladung auf die antibakteriellen Eigenschaften und die Zellbiokompatibilität von Titansubstraten. Sci Rep 12, 8595 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12332-z

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Eingegangen: 14. Februar 2022

Angenommen: 10. Mai 2022

Veröffentlicht: 21. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12332-z

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