Elektrochemischer Nachweis von Harnsäure im unverdünnten menschlichen Speichel mithilfe von in Uricasepapier integrierten Elektroden

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12033 (2022) Diesen Artikel zitieren

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In dieser Studie stellen wir einen in Urikase-immobilisiertes Papier (UOx-Papier) integrierten elektrochemischen Sensor zum Nachweis von Harnsäure (UA) im Speichel vor. Das UOx wurde auf der Nachweiszone im mit Wachsmuster versehenen Papiersubstrat immobilisiert. Dieses UOx-Papier wurde nach der Elektropolymerisation von o-Phenylendiamin mit einer mit Berliner Blau modifizierten, siebgedruckten Kohlenstoffelektrode integriert, um eine elektrochemische Zelle für kleine Probenvolumina (20 μl) zu konstruieren. Zunächst haben wir die Herstellungsbedingungen von UOx-Papier optimiert. Als nächstes wurde die amperometrische Reaktion des UOx-Papier-basierten elektrochemischen UA-Sensors unter Verwendung einer bekannten Konzentration von UA-Standardlösung in künstlichem Speichel bei einem angelegten Potential von –0,1 V (gegenüber einer Ag-Pseudo-Referenzelektrode) analysiert. Der auf UOx-Papier basierende elektrochemische UA-Sensor zeigte eine Empfindlichkeit von 4,9 μA·mM−1 in einem linearen Bereich von 50 bis 1000 μM (R2 = 0,998), hohe Selektivität und gute Reproduzierbarkeit sowie eine Nachweisgrenze von 18,7 μM ( 0,31 mg/dL) UA. Schließlich haben wir die UA-Werte in unverdünnten Speichelproben von gesunden Kontrollpersonen (n = 20) und Gichtpatienten (n = 8) quantifiziert. Die Werte wurden mit den Werten korreliert, die mit herkömmlichen enzymatischen Tests auf UA im Speichel gemessen wurden, sowie mit den UA-Spiegeln im Serum. Der auf UOx-Papier basierende elektrochemische UA-Sensor ist ein benutzerfreundliches und praktisches Werkzeug zur Beurteilung der UA-Werte im Speichel.

Harnsäure (UA), das Endprodukt des Purinstoffwechsels im menschlichen Körper, spielt eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl physiologischer und pathologischer Erkrankungen, einschließlich Gicht1,2,3. UA ist ein Antioxidans und es wurde berichtet, dass Hypourikämie mit immunvermittelten oder degenerativen neurologischen Erkrankungen wie Multipler Sklerose, Parkinson-Krankheit oder Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht wird3. Rezidivierende aphthöse Stomatitis und oraler Lichen ruber waren ebenfalls mit niedrigen UA4,5-Werten im Speichel verbunden. Allerdings trägt Hyperurikämie zur Entstehung und zum Fortschreiten von Gicht, metabolischem Syndrom, chronischer Nierenerkrankung oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei3. Obwohl Hyperurikämie nicht immer zu Gicht führt und die Diagnose Gicht nicht allein auf Hyperurikämie beruht, entwickelt sich Gicht bei Personen mit Hyperurikämie, was zur Ablagerung von Mononatriumuratkristallen im Gewebe führt. Aktuelle Leitlinien für die Behandlung von Gicht empfehlen, dass die harnsäuresenkende Therapie optimiert werden sollte, um einen Serum-UA-Spiegel von < 5–6 mg/dl, jedoch nicht < 3 mg/dl zu erreichen und aufrechtzuerhalten6,7. Daher ist die Überwachung des UA im Serum für die Diagnose, Behandlung und Nachsorge von Hyperurikämie und Gicht unverzichtbar. Allerdings ist eine Venenpunktion invasiv und kann zu Komplikationen wie Verletzungen und Blutungen führen. Darüber hinaus erfordert die Analyse von Serum-UA eine Laborumgebung mit Spezialgeräten.

Die Speicheldiagnostik hat in den Bereichen, in denen Point-of-Care-Tests (POCT) eingesetzt werden, und in klinischen Anwendungen zur häufigen und einfachen Überwachung von Krankheiten sowie zur Vorhersage von Ergebnissen nach der Behandlung zunehmende Aufmerksamkeit auf sich gezogen, da der Speichel den physiologischen und pathologischen Status des Körpers widerspiegelt8 ,9. UA wird hauptsächlich in der Leber und im Darm produziert. Die meisten UA werden über Urattransporter über die Nieren und den Darm ausgeschieden. Allerdings werden auch organische Anionen- und Urattransporter in den Speicheldrüsen exprimiert10. Darüber hinaus berichteten mehrere klinische Studien in den meisten Fällen über einen linearen Zusammenhang zwischen Serum- und Speichel-UA-Spiegeln, was auf das Potenzial der Speichel-UA-Bestimmung als Alternative zu Blutuntersuchungen schließen lässt1,2,11,12. Für den Nachweis von UA ​​im Speichel wurden verschiedene Analysemethoden entwickelt, darunter Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)13, Kapillarelektrophorese (CE)14 und enzymatische kolorimetrische Assay-Kits15,16,17,18. Für den täglichen persönlichen Gebrauch sind sie jedoch nicht geeignet, da sie meist zeitaufwändig sind und teure Instrumente und Experten erfordern. Obwohl einige im Handel erhältliche enzymatische Assay-Kits für verschiedene Arten von biologischen Matrizen wie Speichel, Serum und Urin2 verwendet werden können, können sie durch andere Störungen wie Vitamin C, Lipid oder endogene Peroxidase, die in biologischen Proben vorhanden sind, beeinflusst werden verursachen falsche Ergebnisse2,19,20,21,22. Außerdem haben sie ein kurzes Verfallsdatum, da die Peroxidase in den Reagenzien mit Konservierungsmitteln wie Natriumazid23 nicht kompatibel ist. Infolgedessen kann ein überfälliges Reagenz zu einer Verringerung ihrer Empfindlichkeit führen2,24.

Elektrochemische Sensoren erhielten große Aufmerksamkeit aufgrund ihrer praktischen Vorteile, darunter hohe Empfindlichkeit, schnelle Reaktionszeit, Tragbarkeit, niedrige Kosten und einfache Bedienung zur Erkennung von Speichel UA25,26,27. Kim et al. berichteten über einen tragbaren Speichel-UA-Mundschutz-Biosensor, der ein Urikase-modifiziertes Siebdruck-Elektrodensystem (SPE) mit integrierter drahtloser Elektronik verwendet28. Obwohl dieser Mundschutz-Biosensor in der Lage sein könnte, den UA-Spiegel im Speichel kontinuierlich in Echtzeit zu überwachen, ist seine Verwendung aufgrund von Unannehmlichkeiten und Biokompatibilitätsproblemen der Elektronik eingeschränkt. Huang et al. berichteten über ein papierbasiertes elektroanalytisches Gerät zur Speichel-UA-Analyse29. Sie stellten Poly(3,4-ethylendioxythiophen)-Graphenoxid-Verbundwerkstoffe auf Indiumzinnoxid (ITO)-Substraten als Arbeitselektroden her und bedeckten die vorbereitete Elektrode mit einem Stück Papier, um eine dünnschichtige elektrochemische Zelle zu konstruieren. Obwohl dieses Gerät eine hohe Empfindlichkeit aufwies, ist seine Verwendung unpraktisch, da es separate Referenz- und Gegenelektroden erfordert. Daher ist eine einfache, schnelle, kostengünstige und empfindliche Methode für die Analyse von Speichel-UA für POCT von UA-assoziierten Erkrankungen erforderlich.

In dieser Studie haben wir einen einfachen und effektiven elektrochemischen UA-Sensor hergestellt, der auf einem mit Urikase (UOx) immobilisierten Papier (UOx-Papier) und einer mit Preußisch Blau (PrB) modifizierten, siebgedruckten Kohlenstoffelektrode (PrB-SPCE) basiert. Um die Selektivität und den Anti-Biofouling-Schutz der Elektrode zu verbessern, wurde o-Phenylendiamin (o-PD) auf dem PrB-SPCE (PPD/PrB-SPCE) elektropolymerisiert. Das UOx-Papier unter Verwendung eines Linsenreinigungstuchs mit Wachsmuster und einem einzelnen Kreis wurde mit dem PPD/PrB-SPCE integriert, um eine elektrochemische Zelle für kleinvolumige Proben zu konstruieren. Zunächst optimierten wir die Herstellungsbedingungen für die UOx-Immobilisierung auf dem Papier. Als nächstes bewerteten wir die analytische Leistung des in UOx-Papier integrierten elektrochemischen UA-Sensors basierend auf Empfindlichkeit, Selektivität, Reproduzierbarkeit und Stabilität in künstlichem Speichel. Schließlich wurde der UOx-Papier-integrierte elektrochemische UA-Sensor durch Bestimmung der UA-Konzentration in unverdünnten Speichelproben von Nicht-Gicht-Kontrollen (n = 20) und Patienten mit Gicht (n = 8) bewertet und die UA-Spiegel im Serum mit den gemessenen verglichen mit herkömmlichen Salimetrics® Speichel-UA-Enzym-Assay-Kits. Der in UOx-Papier integrierte elektrochemische Sensor zur Erkennung von UA ​​im Speichel ist in Abb. 1 schematisch dargestellt.

Schematische Darstellung des Sensorprinzips und des resultierenden Stromsignals des UOx-Papier-basierten elektrochemischen UA-Sensors sowie der Harnsäurekonzentrationen (mg/dL) in menschlichen Speichelproben.

UA (≥ 99,0 %), UOx (4 Einheiten/mg Candida sp.), o-PD, Natriumsulfat (Na2SO4), Natriumchlorid (NaCl), Calciumchlorid (CaCl2), Kaliumchlorid (KCl), Zitronensäure, Kaliumthiocyanat (KSCN), Ammoniumchlorid (NH4Cl), einbasiges Kaliumphosphat (KH2PO4), zweibasisches Kaliumphosphat (K2HPO4), L-Milchsäure (LA), D-Glucose (Glu), L-Ascorbinsäure (AA), Paracetamol (AP), Rinderserumalbumin (BSA) und Glutaraldehyd (GA)-Lösung wurden von Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Whatman-Linsenreinigungstuch (Klasse 105) wurde bei GE Healthcare Life Sciences (Pittsburgh, PA, USA) bestellt. Alle Reagenzien waren von analytischer Qualität und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Alle wässrigen Lösungen wurden frisch mit entionisiertem Wasser (DW) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 MΩ·cm hergestellt.

Das mit Wachsmuster versehene Papier wurde unter Verwendung eines XeroxColorQube 8570 N-Druckers (Fuji Korea) zur Wachsimprägnierung. Alle elektrochemischen Experimente, einschließlich zyklischer Voltammetrie und Chronoamperometrie (CA), wurden mit einem Compactstat (Ivium Technology, Eindhoven, Niederlande) bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. PrB-SPCE, das eine PrB-modifizierte Kohlenstoff-Arbeitselektrode (4 mm Durchmesser), eine Kohlenstoff-Gegenelektrode und eine Ag-Pseudo-Referenzelektrode enthält, wurde von DropSens (DRP-710, Llanera, Asturien, Spanien) erworben.

Das Linsenreinigungstuch mit hydrophober Wachsbarriere war für eine Elektrode 11 mm breit und 15 mm lang. Die hydrophile Zone hatte einen Durchmesser von 8 mm (Abb. S1 [A] in den Zusatzinformationen (SI)). Die gleichmäßige Imprägnierung des Papiers mit Wachs wurde 120 s lang in einem BF-150C-Trockenofen bei 80 °C durchgeführt. Schließlich wurde das gemusterte Wachspapier aus dem Ofen genommen und schnell auf RT abgekühlt.

Um UOx im Linsenreinigungstuch zu immobilisieren, wurden 30 Einheiten UOx (37,5 mg/ml) mit 2 mg BSA und 1 μL 8 %iger Glutaraldehydlösung in 200 μL Kaliumphosphatpuffer (PB, 0,1 M, pH 7,0) gemischt. , wie in Abb. S1(B) in SI gezeigt. Als nächstes wurden 10 μl der gemischten Lösung auf das Wachspapier getropft und in einem Reinraum (23,5 ± 1,0 °C, 25,0 ± 5,0 %) 40 Minuten lang getrocknet. Um das ungebundene Enzym zu entfernen, wurde dieses Papier mit 0,1 M PB gewaschen. Abschließend wurde das UOx-Papier 30 Minuten lang in einem Reinraum (23,5 ± 1,0 °C, 25,0 ± 5,0 %) getrocknet.

Vor der Herstellung des UA-Sensors bestätigten wir die elektrochemischen Eigenschaften von PrB-SPCE mittels zyklischer Voltammetrie in KCl-Lösung mit einem Potentialbereich von –0,1 bis 0,4 V (gegenüber der Ag-Pseudo-Referenzelektrode) und einer Scanrate von 50 mV/ S. Als nächstes wurde Poly(o-PD) (PPD) auf dem PrB-SPCE durch Polymerisation von o-PD bei 0,7 V (gegen Ag-Pseudo-Referenzelektrode) für 100 s in einer 0,1 M PB-Lösung (pH 7,0) mit 10 abgeschieden mM o-PD und 5 mM Natriumsulfat zur Minimierung von Biofouling und Störungen durch Speichelbestandteile28. Anschließend wurde ein Stück doppelseitiges Klebeband mit einem gestanzten Loch (8 mm Durchmesser) auf die Elektrode geklebt. Schließlich wurde das Band mit einem UOx-immobilisierten Papier bedeckt, um die Probenlösung aufzubewahren und das Drei-Elektroden-System für die elektrochemische Detektion elektrisch anzuschließen.

Die CA-Technik wurde verwendet, um die UA-Erkennungsempfindlichkeit des UOx-Papiers/PPD/PrB-SPCE zu bewerten. Eine Standardlösung von UA ​​wurde in künstlichem Speichel hergestellt, bestehend aus 5 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 15 mM KCl, 1 mM Zitronensäure, 1,1 mM KSCN und 4 mM NH4Cl in DW28. Der pH-Wert des künstlichen Speichels wurde auf 6,7 eingestellt. Verschiedene UA-Konzentrationen wurden mit der CA-Technik bei einem angelegten Potential von –0,1 V (gegenüber der Ag-Pseudo-Referenzelektrode) für 60 s nach 1 min Inkubation in der Standardlösung nachgewiesen. Die Kalibrierungskurve wurde aus CA-Messungen in 20 μl UA in einem Konzentrationsbereich von 50 bis 1000 μM in künstlichem Speichel erhalten.

Diese Studie und Probenentnahme wurden von der Ethikkommission des Seoul National University Bundang Hospital (IRB-Nr. B-1911-577-303) genehmigt und von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Wir haben 8 männliche Patienten mit Gicht (Alter (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM)): 39,1 ± 3,0 Jahre) und 20 Männer ohne Gicht (Alter 40,8 ± 6,4 Jahre) aufgenommen. Serum- und Speichelproben wurden gleichzeitig unter Fastenbedingungen gesammelt. Zusätzlich haben wir 16 gepaarte Proben von Patienten mit Gicht vor und nach Beginn einer harnsäuresenkenden Therapie (Febuxostat (n = 4), Allopurinol (n = 3) oder Benzbromaron (n = 1)) erhalten. Die Behandlungsdauer betrug 2,9 ± 1,1 Monate. Nicht stimulierte Gesamtspeichelproben wurden durch passives Eintropfen in ein Plastikröhrchen gesammelt. Venöse Blutproben wurden zentrifugiert (1500 × g für 15 Minuten bei RT), um Serum zu erhalten. Die gesamten Speichelproben wurden 10 Minuten lang bei 4 ° C und 4500 × g zentrifugiert. Alle Proben wurden bis zur Analyse bei –80 °C eingefroren. Die Serum-UA-Spiegel wurden unter Verwendung kommerziell erhältlicher enzymatischer kolorimetrischer Assay-Kits (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Für die Speichel-UA-Analyse wurden zunächst 20 μl einer unverdünnten Speichelprobe auf das UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE getropft. Nach 60 s Inkubation wurde die CA-Messung 60 s lang bei –0,1 V (gegenüber der Ag-Pseudo-Referenzelektrode) durchgeführt. Die UA-Konzentration in der Speichelprobe wurde aus der Steigung der Kalibrierungskurve berechnet. Zusätzlich wurden die UA-Spiegel im Speichel unter Verwendung eines enzymatischen Speichel-UA-Assay-Kits (Salimetrics LLC, Philadelphia, PA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

Kontinuierliche Variablen werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Zum Vergleich der beiden Gruppen wurde ein unabhängiger Stichproben-T-Test verwendet. Der gepaarte T-Test wurde verwendet, um die UA-Werte vor und nach der Therapie zur Harnsäuresenkung zu vergleichen. Eine einfaktorielle ANOVA wurde verwendet, um die UA-Werte in drei Gruppen zu vergleichen, und der exakte Fisher-Test wurde durchgeführt, um kategoriale Daten zu analysieren. Pearson-Korrelationskoeffizienten wurden berechnet, um die Beziehung zwischen den UA-Spiegeln im Serum und im Speichel oder zwischen den mit dem vorbereiteten UA-Sensor gemessenen UA-Spiegeln im Speichel und der herkömmlichen Methode zu analysieren. Für die statistische Signifikanz wurde ein p-Wert von 0,05 berücksichtigt. Die statistische Analyse wurde mit IBM® SPSS Statistics, Version 25 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) durchgeführt.

Typischerweise nutzen UA-Biosensoren Enzyme wie UOx mit hoher Spezifität für UA. Da die UOx-basierte amperometrische Detektion von UA ​​jedoch im Allgemeinen ein relativ hohes Potential (> + 0,65 V) zur Messung des Wasserstoffperoxidprodukts (H2O2) erfordert, unterliegt sie verschiedenen elektroaktiven Störungen. PrB oder Eisenhexacyanoferrat wird als „künstliche Peroxidase“ bezeichnet, da es den Elektronentransport verbessern und die Reduktion von H2O2 bei niedrigem Überpotential katalysieren kann30,31. Daher bietet PrB-SPCE einen selektiven kathodischen Nachweis von H2O2, das durch die enzymatische Reaktion von UA ​​entsteht. Allerdings kann sich das PrB in neutralen oder schwach alkalischen Lösungen zersetzen32. Darüber hinaus ist Speichel aufgrund seiner hohen Viskosität und Proteinzusammensetzung sowie anderer elektroaktiver Spezies eine komplexe und schwer zu handhabende Matrix33. Um die Stabilität, Selektivität und Biokompatibilität von PrB-SPCE zu verbessern, haben wir durch Elektropolymerisation eine externe schützende Polymermembran wie PPD auf PrB-SPCE eingeführt. PPD-Membranen sind für ihre Fähigkeit bekannt, Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht wie H2O2 zu durchdringen und andere elektroaktive Spezies wie AA und AP zurückzuweisen sowie Biofouling auf der Elektrode zu verhindern28,34. Um die elektrokatalytische Eigenschaft von PPD/PrB-SPCE gegenüber H2O2 zu charakterisieren, führten wir zyklische Voltammetriemessungen in künstlichem Speichel mit und ohne 1 mM H2O2 im Potentialbereich von –0,20 bis +0,40 V (gegen Ag-Pseudo-Referenzelektrode) bei a durch Scanrate von 50 mV/Sek. Wie in Abb. 2a gezeigt, zeigte das PPD/PrB-SPCE die charakteristische Redoxaktivität von Prussian White (PrW)/PrB (0,02/0,13 V) in der künstlichen Speichellösung. Der kathodische Spitzenstrom stieg auf −12,3 μA bei −0,00 V in 1 mM H2O2-Lösung. Um die elektrochemische Leistung von PPD/PrB-SPCE gegenüber H2O2 zu bestätigen, wurde die CA-Technik bei einem angelegten Potential von –0,1 V (gegenüber der Ag-Pseudo-Referenzelektrode) verwendet. Die Selektivität von PPD/PrB-SPCE wurde durch die aktuelle Reaktion von H2O2 in Gegenwart physiologischer Konzentrationen der relevanten elektroaktiven Bestandteile des Speichels, einschließlich UA, AA und AP, bestätigt. Wie in Abb. 2b und 2c dargestellt, waren die Störströme aufgrund von UA ​​(1000 μM), AA (500 μM) und AP (500 μM) vernachlässigbar, verglichen mit der starken Reaktion aufgrund von H2O2 (50, 100 und 200). μM). Insbesondere waren die aktuellen Reaktionen von AA (– 0,12 ± 0,02 μA, [Mittelwert ± Standardabweichung]) und AP (– 0,06 ± 0,002 μA) auf PPD/PrB-SPCE signifikant niedriger als die auf PrB-SPCE (– 0,17 ±). 0,01 μA für AA bzw. − 0,14 ± 0,01 μA für AP). Allerdings war der kathodische Strom von H2O2 (− 0,35 μA ± 0,01 μA) auf PPD/PrB-SPCE und PrB-SPCE (− 0,38 ± 0,01 μA) ähnlich. Dieses Ergebnis zeigt, dass PPD/PrB-SPCE eine hohe Selektivität für den Nachweis von H2O2 aufweist, ohne dass es zu Störungen durch mögliche elektroaktive Spezies im Speichel kommt. Darüber hinaus hemmte die externe PPD-Membran nicht die Permeabilität von H2O2 gegenüber PrB-SPCE.

(a) Zyklische Voltammogramme von PPD/PrB-SPCE in einer künstlichen Speichellösung mit und ohne 1,0 mM H2O2 bei einem Potential im Bereich von –0,2 bis 0,4 V (gegenüber der Ag-Pseudo-Referenzelektrode) und einer Scanrate von 50 mV/s . (b) Aktuelle Reaktion auf 0, 50, 100 und 200 μM H2O2 von PPD/PrB-SPCE im Vergleich zur Reaktion auf häufige elektroaktive Störungen, einschließlich 1000 μM UA, 500 μM AA und 500 μM AP. (c) Vergleich der elektrochemischen Reaktion von PPD/PrB-SPCE und PrB-SPCE auf 50 μM H2O2 und 1000 μM UA bzw. 500 μM AA und 500 μM AP bei –0,1 V (gegenüber der Ag-Pseudoreferenz). Elektrode). Einfluss von (d) UOx-Konzentration, (e) Tropfenvolumen der UOx-Mischung und (f) UOx-Immobilisierungsmethode auf die Analyse von 1000 μM UA. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts dar (n = 3).

Papierbasierte Analyseplattformen haben mehrere Vorteile, darunter niedrige Kosten, einfache Herstellung und sind in vielen Anwendungen wie biochemischen und analytischen Sensoren einfach zu verwenden35. Darüber hinaus lässt sich Papier durch Wachsdrucken mit einem ungiftigen Reagenz ganz einfach nach dem gewünschten Muster gestalten. Um Papier als bioanalytisches Werkzeug für den UA-Nachweis zu verwenden, haben wir eine einzelne Zone entworfen, die in das Drei-Elektroden-System von SPCE integriert wurde. Als nächstes immobilisierten wir UOx in der hydrophilen Zone von wachsgemustertem Linsenpapier zur Verwendung als Probenabsorptionsbereich sowie als elektrochemische Zelle, um die Reaktion zwischen UOx und UA innerhalb der Proben zu erleichtern. Daher war es notwendig, die experimentellen Bedingungen, einschließlich Papiertyp, UOx-Konzentration und Volumen der UOx-Mischung, zu optimieren, um eine effiziente Immobilisierung von UOx auf dem Papier zu gewährleisten.

Zunächst haben wir die Papiersorten, einschließlich Whatman Nr. 1, Nr. 114 und Linsenreinigungstücher Nr. 105, für die Immobilisierung von UOx optimiert. Da sich die Porengröße und -dicke je nach Papiertyp unterscheiden (Tabelle S1), variiert das Ergebnis der Erkennung aufgrund der Unterschiede in der Lösungsflussrate auf der Papieroberfläche und der Materialgleichmäßigkeit36. Daher scheint die richtige Papierauswahl entscheidend für die Verbesserung des aktuellen Signals papierbasierter Biosensoren zu sein. Der Einfluss des Papiertyps wurde anhand der kathodischen Stromreaktion von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE auf 1000 μM UA bei –0,1 V (gegenüber der Ag-Pseudo-Referenzelektrode) untersucht. Wie in Abb. S1(C) gezeigt, war der UA-Strom im Linsenreinigungsgewebe am höchsten, das am dünnsten war und die breitesten Poren aufwies. Um die elektrochemische Reaktion des UOx-Papiers/PPD/PrB-SPCE zu verbessern, haben wir die UOx-Konzentration und das Tropfenvolumen der UOx-Mischung optimiert. Abbildung 2d zeigt die Änderung der kathodischen Stromreaktion von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE bei –0,1 V (gegenüber der Ag-Pseudo-Referenzelektrode) entsprechend der UOx-Konzentration (0, 12,5, 25, 37,5, 50, und 62,5 mg/ml). Der UA-Strom stieg mit der Erhöhung der UOx-Konzentration von 12,5 auf 37,5 mg/ml. Als die UOx-Konzentration weiter anstieg, nahm der kathodische Strom des UOx/PPD/PrB-SPCE ab. Wenn die UOx-Konzentration außerdem auf 37,5 mg/ml festgelegt wurde, betrug das optimale Tropfenvolumen der UOx-Mischung 10 μl (Abb. 2e)). Das erhöhte Tropfenvolumen der UOx-Mischung führte zu einem verringerten Stromsignal.

GA ist eines der am häufigsten verwendeten bifunktionellen Reagenzien für die intermolekulare Vernetzung von Proteinen, das durch die Reaktion zwischen Aldehyden des Vernetzers und Aminen des Proteins kovalente Bindungen bildet37,38. Wenn Enzyme jedoch direkt mit GA vernetzt sind, neigen sie dazu, ihre Aktivität zu verlieren. Daher kann eine milde Vernetzung mit GA unter Verwendung eines an Aminogruppen reichen Feeders wie BSA die Stabilität des Enzyms erhöhen, indem die chemische Modifikation der internen Aminogruppen des Enzyms verringert wird39. Außerdem kann es die Porosität des Films verringern und so die Reaktionsfähigkeit des Films erhöhen40. Infolgedessen erzeugte das UOx-Papier, das unter Verwendung von GA und BSA als Vernetzer und Stabilisator hergestellt wurde, einen höheren Strom (– 5,04 ± 0,35 μA) als das Papier, das nur unter Verwendung von UOx (– 4,03 ± 0,14 μA) hergestellt wurde (Abb. 2f). Der Einschub zeigt das gefärbte Bild von UOx-Papier mit Ponceau S, das im Allgemeinen zum Nachweis von Proteinen auf Celluloseacetat- und Nitrocellulosemembranen verwendet wird41. Die Proteine ​​auf dem UOx-Papier färbten sich mit Ponceau S-Farbstoff rot. Basierend auf dem aktuellen Signal und dem gefärbten Bild des UOx-Papiers haben wir bestätigt, dass UOx erfolgreich auf dem Papier immobilisiert wurde. In weiteren Experimenten wurden die optimalen Bedingungen von 37,5 mg/ml UOx und 10 μL UOx-Gemisch mit BSA und GA auf den Linsenreinigungstüchern Nr. 105 verwendet.

Wir untersuchten die analytische Leistung von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE für den UA-Nachweis mithilfe der CA-Technik. Die Stromreaktionen von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE in 20 μl künstlicher Speichellösungen mit verschiedenen UA-Konzentrationen (01000 μM) wurden bei einem angelegten Potential von –0,1 V (gegenüber der Ag-Pseudo-Referenzelektrode) gemessen. Wie in Abb. 3a gezeigt, nahm der Kathodenstrom von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE mit zunehmender UA-Konzentration zu. Die Reaktion des UOx-Papiers/PPD/PrB-SPCE war in Bezug auf die UA-Konzentration bis zu 1000 μM (R2 = 0,998) linear, mit einer Nachweisgrenze von 13,3 μM gemäß der Standardabweichung des Blindwerts und der Steigungsmethode ( 3 sbl/Steigung)42 und eine Nachweisempfindlichkeit von 5,0 μA·mM−1 (39,8 μA·mM−1·cm−2). Allerdings war die aktuelle Reaktion von UOx-Membran/PPD/PrB-SPCE, bei der UOx direkt auf PPD/PrB-SPCE unter Verwendung von GA und BSA immobilisiert wurde, geringer als die von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE. Infolgedessen war die Steigung der Kalibrierungskurve von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE etwa dreimal höher als die von UOx-Membran/PPD/PrB-SPCE (1,7 μA·mM−1). Tabelle 1 zeigt einen Vergleich der Sensorleistung unseres UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE mit der anderer UOx-basierter SPCEs zur Erkennung von Speichel-UA. Die Leistung unseres UA-Sensors war gut im Hinblick auf ein geringes Probenvolumen und einen großen linearen Bereich bei mäßiger Empfindlichkeit. Der Nachweisbereich umfasste insbesondere alle Konzentrationen von UA ​​im Speichel, von gesunden Kontrollpersonen bis hin zu Gichtpatienten.

(a) Die Kalibrierungskurve des Kathodenstroms vs. UA-Konzentration im Vergleich von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE und UOx-Membran/PPD/PrB-SPCE bei − 0,1 V (vs. Ag-Pseudo-Referenzelektrode) , jeweils. (b) Die aktuelle Reaktion auf 500 μM UA von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE bei –0,1 V (gegenüber einer Ag-Pseudo-Referenzelektrode) im Vergleich zur Reaktion auf häufige elektroaktive physiologische Störungen, einschließlich 800 μM Glucose, 200 μM AA, 100 μM AP und 1000 μM LA. (c) Reproduzierbarkeit von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE mit unterschiedlichen Herstellungsdaten, basierend auf der aktuellen Reaktion auf 500 μM UA in künstlichem Speichel bei –0,1 V (gegenüber einer Ag-Pseudo-Referenzelektrode). (d) Stabilität von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE basierend auf der aktuellen Reaktion auf 500 μM UA, gelagert für 28 Tage bei 4 °C. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts dar (n = 3).

Um die Selektivität des UOx-Papiers/PPD/PrB-SPCE zu bewerten, verglichen wir die aktuellen Reaktionen von 500 μM UA mit denen anderer potenziell störender Substanzen, einschließlich 800 μM Glu, 200 μM AA, 100 μM AP und 1000 μM LA. Wie in Abb. 3b gezeigt, verursachte nur UA eine dramatische Änderung des elektrischen Stroms, während die durch Glu, AA, AP und LA verursachten Interferenzströme vernachlässigbar waren. Dieses Ergebnis zeigte, dass UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE eine hohe Selektivität für den Nachweis von UA ​​ohne Auswirkungen möglicher Störstoffe aufwies. Zusätzlich zu Störfaktoren stellt die unspezifische Adsorption von Biomolekülen oder Mikroben eine dauerhafte und allgegenwärtige Bedrohung für Grenzflächen dar, die biologischen Flüssigkeiten ausgesetzt sind, und kann in der Folge die Funktion von Biosensoren teilweise oder vollständig beeinträchtigen43. PPD ist dafür bekannt, in proteinhaltigen Medien Anti-Biofouling-Eigenschaften zu haben, möglicherweise aufgrund seiner größeren Kompaktheit44,45. Wir haben die Anti-Biofouling-Fähigkeit von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE anhand von künstlichen Speichel- und echten Speichelproben getestet. Wie in Abb. S2 gezeigt, blieb die aktuelle Reaktion von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE auf UA (300 μM), das mit echtem Speichel versetzt war, bei 86 % und bei 92 % derjenigen bei künstlichem Speichel erhalten. Aber UOx-Papier/PrB-SPCE ohne PPD zeigte 63 % bzw. 68 % seiner aktuellen Reaktion in echtem Speichel im Vergleich zu künstlichem Speichel. Daher gingen wir davon aus, dass PPD wirksam sein könnte, um die unspezifische Adhäsion von Proteinen an der Elektrodenoberfläche zu minimieren.

Darüber hinaus untersuchten wir die Reproduzierbarkeit von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE, indem wir die aktuelle Reaktion auf UA (500 μM) mit 10 Sensoren an verschiedenen Herstellungsdaten maßen. Da der Variationskoeffizient (CV) unseres UA-Sensors 4,8 % betrug (Abb. 3c), war das UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE hoch reproduzierbar. Die Stabilität wurde getestet, indem die aktuelle Reaktion von UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE auf 500 μM UA während einer 28-tägigen Lagerung bei 4 °C bewertet wurde. Wie in Abb. 3d dargestellt, gab es innerhalb von 28 Tagen keine signifikante Änderung des Stroms (~ 97 % der ursprünglichen Reaktion), was auf die Stabilität des UOx-Papiers/PPD/PrB-SPCE schließen lässt.

Speichel ist eine biologische Flüssigkeit, die aufgrund ihrer vielen Vorteile, einschließlich der nicht-invasiven Sammlung, der einfach zu verwendenden Probe und der kostengünstigen Lagerung, in der klinischen Diagnose und Behandlung von Patienten verwendet wird48. Seine routinemäßige Verwendung wird jedoch durch eine weitere Verdünnung der Analyten, Beeinträchtigungen durch Nahrungsmittel oder den Gesundheitszustand des Parodonts oder der Speicheldrüsen eingeschränkt. Insbesondere Speichel ist eine schwierige und komplexe Matrix für die biologische Analyse, da viele Bestandteile im Speichel die Reaktion des interessierenden Analyten beeinflussen können49. Daher ist eine hochempfindliche und selektive Methode zum Nachweis von UA ​​im Speichel erforderlich.

Um die Eignung unseres UA-Sensors für POCT zu bewerten, haben wir die UA-Konzentrationen im Speichel von Nicht-Gicht-Kontrollen (n = 20) und Patienten mit Gicht (n = 8) gemessen. Darüber hinaus haben wir bei Patienten mit Gicht die UA-Spiegel im Speichel vor und nach der harnsäuresenkenden Therapie bestimmt. Die Ergebnisse wurden mit denen kommerzieller Speichel-UA-Enzymtests (Salimetrics®) verglichen, zusammen mit den Serum-UA-Spiegeln als Referenzwerten.

Erstens waren die Serum-UA-Spiegel bei Patienten mit Gicht signifikant höher (10,23 ± 0,36 mg/dl, Mittelwert ± SEM) als bei Nicht-Gicht-Kontrollen (6,20 ± 0,22 mg/dl, p = 8,77 × 10–10; Abb. 4a). . Hyperurikämie (definiert als Serum-UA ≥ 7,0 mg/dl) war in der Gichtgruppe signifikant häufiger als in der Kontrollgruppe (100 % vs. 20 %, p = 1,59 × 10–10). Eine harnsäuresenkende Therapie senkte die Serum-UA bei 3/8 (37,5 %) Gichtpatienten auf Konzentrationen unter 6,0 mg/dl.

Harnsäurespiegel (UA) im Serum und in nicht stimulierten Speichelproben. (a) Patienten mit Gicht (n = 8) zeigten signifikant höhere Serum- oder Speichel-UAW-Werte als Kontrollpersonen (n = 20, alle p < 0,05). Die mit unserem UA-Sensor gemessenen UA-Spiegel im Speichel waren sowohl bei Kontrollen als auch bei Gichtfällen signifikant niedriger als die UA-Spiegel im Serum und im Speichel, die mit herkömmlichen enzymatischen kolorimetrischen Tests gemessen wurden (beide p < 0,0001 gemäß ANOVA). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. (b) Die UA-Spiegel im Serum oder Speichel (gemessen mit Salimetrics® und dem UA-Sensor) korrelierten signifikant positiv miteinander.

Als nächstes betrugen die UA-Werte im Speichel 2,34 ± 0,25 mg/dl in der Kontrollgruppe und 7,51 ± 1,09 mg/dl in der Gichtgruppe, basierend auf dem Salimetrics®-Assay (p = 0,002, Abb. 4a); Die UA-Werte im Speichel waren in den Seren der Kontrollpersonen um 37,7 % und in den Seren von Gichtpatienten um 73,4 % niedriger. Im Falle des hergestellten UA-Sensors betrugen die UA-Werte im Speichel 1,05 ± 0,15 mg/dl in der Kontrollgruppe und 3,54 ± 0,81 mg/dl in der Gichtgruppe (p = 0,018; Abb. 4a). Diese Speichelspiegel entsprachen 34,6 % bzw. 16,9 % der Serum-UA-Spiegel in der Gicht- bzw. Kontrollgruppe. Bei beiden Methoden waren die UA-Werte im Speichel in der Gichtgruppe signifikant höher als in der Kontrollgruppe, obwohl sie deutlich niedriger waren als die UA-Werte im Serum. Die Ergebnisse stimmten mit denen früherer Studien überein11,12,13,14. Allerdings waren die UA-Spiegel im Speichel basierend auf dem Salimetrics®-Assay signifikant höher als diejenigen, die mit dem vorbereiteten UA-Sensor bei allen Probanden erhalten wurden (p = 5,26 × 10−13), besonders hoch im niedrigen Konzentrationsbereich unter 2 mg/dl durch den UA-Sensor (Abb. 4b). Dieser Unterschied in den UA-Spiegeln im Speichel zwischen zwei Methoden kann auf die große Variabilität des enzymatischen Testkits bei niedrigen UA-Konzentrationen sowie auf Störungen aufgrund endogener Verbindungen zurückgeführt werden. Möglicherweise liegt es auch an der verminderten Diffusion von Signalmolekülen im vorbereiteten UA-Sensor. Erstens nutzt der Salimetrics®-Assay eine enzymatische Reaktionsmischung, die den Nachweis von UA ​​durch die Produktion eines roten Chromogens ermöglicht. UOx oxidiert UA zu Allantoin und H2O2. Und dann wird H2O2 in der zweiten enzymatischen Reaktion durch Peroxidase verwendet, um ein Chromogen zu bilden, das bei einer Wellenlänge von 515 (oder 520) nm quantitativ gemessen wird. Obwohl dieser enzymatische Assay einfach und im Handel erhältlich ist, ist die Chromogenbildung durch Peroxidase-katalysierte Reaktion von H2O2 anfällig für Störungen durch endogene Störkomponenten in biologischen Matrizen und kann schließlich zu falsch positiven oder negativen Ergebnissen führen19,20,21,22. Der Salimetrics®-Assay erfordert eine Zentrifugation, um Mucine und andere Störstoffe aus Speichelproben zu entfernen, er kann jedoch mehrere Verbindungen, die als Störer wirken können, nicht perfekt eliminieren. Zweitens haben wir die Präzision von Tag zu Tag unter Verwendung des UA-Standards (5 mg/dl) und der Kontrollen (hoch und niedrig) im selben Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Wie in Tabelle S2 gezeigt, betrug der CV für den UA-Standard, der zur Berechnung der UA-Konzentration verwendet wurde, 8,8 % und die hohe Kontrolle (geschätzt auf 8,6 mg/dl) zeigte einen CV von weniger als 5 %. Der CV für die Kontrollgruppe „Niedrig“ (geschätzt auf 2,5 mg/dl) betrug jedoch bis zu 36 % (Tabelle S2). Dieses Ergebnis kann auf die relativ geringe Empfindlichkeit gegenüber niedrigen UA-Konzentrationen zurückgeführt werden. Und es kann zu einigen Einschränkungen enzymatischer Tests führen, wie z. B. der großen Abweichung der Testergebnisse und der Kit-zu-Kit-Variabilität, die in mehreren Studien erwähnt wurden2,19,24,50. Im Gegensatz dazu betrug der CV des UA-Sensors im niedrigen Konzentrationsbereich von 1,7 bis 5 mg/dL allesamt weniger als 5 % (Tabelle S3). Und der vorbereitete UA-Sensor, UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE, der keine Peroxidase verwendete, wurde mit zwei Arten von Membranen hergestellt, darunter UOx-Papier und PPD, um die Interferenz aufgrund mehrerer Komponenten im Speichel zu minimieren. Diese Schutzschichten können jedoch die Diffusion des Signalmoleküls verringern, was zu verringerten UA-Werten führt. Die in der Kontrollgruppe gemessenen UA-Werte im Speichel stimmen jedoch mit früheren Studien überein, die mittels HPLC-UV oder elektrochemischer Methode analysiert wurden14,29,50. Darüber hinaus war der mittlere UA-Spiegel im Speichel in der Gichtgruppe, die den UA-Sensor verwendete, 3,37-mal höher als in der Kontrollgruppe, was dem 3,21-fachen im Salimetrics®-Assay ähnelte. Die mit zwei Methoden gemessenen UA-Spiegel in Serum und Speichel korrelierten signifikant miteinander (Pearson-Korrelationskoeffizienten lagen zwischen 0,631 und 0,788, Abb. 4b).

Die Harnsäure senkende Therapie reduzierte die Serum-UA-Spiegel in der Gichtgruppe signifikant von 10,23 ± 0,36 mg/dl auf 7,84 ± 0,84 mg/dl (p = 0,015), wie in Abb. 5a dargestellt. Obwohl die UA-Spiegel im Speichel im Salimetrics®-Assay tendenziell von 7,51 ± 1,09 auf 5,78 ± 0,90 mg/dl und mit dem UA-Sensor von 3,54 ± 0,81 auf 2,75 ± 0,95 mg/dl abnahmen, wurde keine statistische Signifikanz beobachtet. Wie in Abb. 5b gezeigt, korrelierten die Veränderungen des Speichelharnsäurespiegels bei Verwendung des Salimetrics®-Assays nicht mit denen der Serum-UA-Spiegel. Dennoch zeigte unser UA-Sensor, dass die Veränderung der UA-Spiegel im Speichel signifikant mit der Veränderung der UA-Spiegel im Serum korrelierte (Pearson-Korrelationskoeffizient = 0,982). Dies könnte auf eine geringere Interferenz des UA-Sensors zurückzuführen sein, was zu einer genauen Erkennung von UA ​​im Speichel führt, selbst im niedrigen Konzentrationsbereich von UA. Daher ist der vorgeschlagene UA-Sensor äußerst zuverlässig für die Messung der UA im Speichel. Zu den Vorteilen unseres UA-Sensors, UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE, gehören: (1) Empfindlichkeit und Spezifität für UA in unverdünntem menschlichen Speichel; (2) Nachweis von UA ​​in einem kleinen Volumen (20 μl) einer Speichelprobe; (3) der schnelle Nachweis (innerhalb von nur 2 Minuten) von UA ​​(Inkubation 1 Minute + Nachweis 1 Minute) und die einfache Handhabung. Daher kann der hergestellte UA-Sensor als einfaches, schnelles und zuverlässiges Werkzeug zur Bestimmung des UA-Spiegels im Speichel verwendet werden, der den UA-Spiegel im Serum widerspiegeln kann.

Veränderung des Harnsäurespiegels (UA) in Serum- und unstimulierten Gesamtspeichelproben nach einer uratsenkenden Therapie. (a) Bei Patienten mit Gicht (n = 8) sanken die Serum-UA-Spiegel nach der Behandlung signifikant. Die UA-Werte im Speichel wurden jedoch unabhängig von der verwendeten Methode nicht signifikant verändert. (b) Änderungen des UA im Serum korrelierten signifikant mit Änderungen der UA-Spiegel im Speichel, die mit unserem UA-Sensor gemessen wurden (p < 0,0001), jedoch nicht mit dem Salimetrics®-Assay.

Zusammenfassend haben wir einen einfachen und zuverlässigen elektrochemischen UA-Sensor eingeführt, der UOx-Papier verwendet und in PPD/PrB-SPCE integriert ist. Das UOx-Papier fungiert als Probenabsorptionsbereich für die Reaktion zwischen UOx und UA und dient außerdem als Filter, um Störungen im Speichel zu verhindern. PPD verbessert die Selektivität und den Anti-Biofouling der Elektrode. Als Ergebnis zeigte das vorbereitete UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE eine robuste Empfindlichkeit für UA mit einem breiten linearen Bereich, hoher Selektivität und guter Reproduzierbarkeit und erforderte ein geringes Probenvolumen. Mit diesem UA-Sensor haben wir die UA-Spiegel im unverdünnten, nicht stimulierten Speichel gemessen und anschließend die UA-Spiegel im Serum mit denen verglichen, die auf herkömmlichen UA-Assays (Salimetrics®) basieren. Obwohl die mit Salimetrics®-Assays ermittelten UA-Spiegel im Speichel deutlich höher waren als die mit unserem UA-Sensor gemessenen, korrelierten sie signifikant mit den UA-Spiegeln im Serum. Darüber hinaus zeigte unser UA-Sensor, dass Änderungen des UA-Spiegels im Speichel die Änderungen des UA-Spiegels im Serum besser widerspiegeln als der Salimetrics®-Assay. Daher gehen wir davon aus, dass der vorbereitete UA-Sensor UOx-Papier/PPD/PrB-SPCE im POCT zur Bewertung der UA-Spiegel im Speichel bei Patienten mit UA-assoziierten Erkrankungen eingesetzt wird.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Diese Forschung wurde durch den Zuschuss des Korea Medical Device Development Fund unterstützt, der von der koreanischen Regierung (dem Ministerium für Wissenschaft und IKT, dem Ministerium für Handel, Industrie und Energie, dem Ministerium für Gesundheit und Soziales, dem Ministerium für Lebensmittel- und Arzneimittelsicherheit) finanziert wurde. Projekt-Nr. KMDF_PR_20200901_0023, 1711137928] und von der koreanischen Regierung finanziertes Stipendium der National Research Foundation (Nr. NRF-2021R1A2C1093825).

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Yun Jong Lee und Gi-Ja Lee.

Abteilung für Medizintechnik, Kyung-Hee-Universität, Graduiertenschule, Seoul, 02447, Republik Korea

Seong Hyun Han & Gi-Ja Lee

Abteilung für Rheumatologie, Abteilung für Innere Medizin, Seoul National University Bundang Hospital, Seongnam-si, Gyeonggi-do, 13620, Republik Korea

You-Jung Ha, Eun Ha Kang und Yun Jong Lee

Abteilung für Rheumatologie, Boramae Medical Center der Seoul Metropolitan Government-Seoul National University, Seoul, 07061, Republik Korea

Kichul Shin

Abteilung für Entwicklung medizinischer Geräte, Seoul National University Graduate School, Seongnam-si, Gyeonggi-do, 13605, Republik Korea

Yun Jong Lee

Abteilung für Biomedizintechnik, College of Medicine, Kyung Hee University, #1 Kyungheedae-ro, Dongdaemun-gu, Seoul, 02447, Republik Korea

Gi-Ja Lee

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Y.-JH, YJL und G.-JL trugen zur Konzeption und Gestaltung der Studie bei. Die Materialvorbereitung, Datenerfassung und Analyse wurden von allen Autoren durchgeführt. Der erste Entwurf des Manuskripts wurde von SHH und G.-JL verfasst, und YJL, EHK, Y.-JH und KS kommentierten frühere Versionen des Manuskripts. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Yun Jong Lee oder Gi-Ja Lee.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 16. März 2022

Angenommen: 06. Juli 2022

Veröffentlicht: 14. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16176-5

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