Proliferation von Osteoblasten-Vorläuferzellen auf der Oberfläche von TiO2-Nanodrähten, die anodisch auf einem β gewachsen sind

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 7895 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Studien haben gezeigt, dass anodisch gewachsene TiO2-Nanoröhren (TNTs) eine hervorragende Biokompatibilität aufweisen. Allerdings haben TiO2-Nanodrähte (TNWs) weniger Beachtung gefunden. Ziel dieser Studie war es, die Proliferation von Osteoblasten-Vorläuferzellen auf den Oberflächen von TNWs zu untersuchen, die durch elektrochemische Anodisierung einer Ti-35Nb-7Zr-5Ta (TNZT)-Legierung gezüchtet wurden. Als Kontrollproben wurden TNT- und flache TNZT-Oberflächen verwendet. MC3T3-E1-Zellen wurden bis zu 5 Tage lang auf den Oberflächen der Proben kultiviert und die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen wurden mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie, kolorimetrischem Assay und Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Die Ergebnisse zeigten geringere Zellproliferationsraten auf der TNW-Oberfläche im Vergleich zu Kontrollproben ohne signifikante Unterschiede im Zellüberleben unter den Versuchsbedingungen. Kontaktwinkelmessungen zeigten ein gutes Maß an Hydrophilie für die TNWs, ihr relativ geringer Durchmesser und ihre hohe Dichte könnten jedoch die Zellproliferation beeinflusst haben. Obwohl weitere Forschung erforderlich ist, um alle Parameter zu verstehen, die die Biokompatibilität beeinflussen, könnten diese TiO2-Nanostrukturen unter anderem vielversprechende Werkzeuge für die Behandlung von Knochendefekten und die Regeneration von Knochengewebe darstellen.

Titan und seine Legierungen haben eine hohe spezifische Festigkeit (Festigkeits-Gewichts-Verhältnis) und die beste Biokompatibilität unter den Metallen. Titan bildet auf seiner Oberfläche auf natürliche Weise ein Oxid (TiO2), das es auch in wässrigen Medien wirksam vor Korrosion schützt. Daher ist Titan trotz seiner relativ hohen Produktionskosten für viele Anwendungen vorteilhaft, insbesondere in der Luft- und Raumfahrt1 und der biomedizinischen Industrie2. Bei niedrigen Temperaturen hat reines Titan eine hexagonal dicht gepackte Kristallstruktur, die sogenannte α-Phase, die bei 882 °C eine allotrope Umwandlung in eine kubisch-raumzentrierte Struktur, die sogenannte β-Phase, durchläuft. Um die β-Phase bei niedrigeren Temperaturen zu stabilisieren, können dem Titan Legierungselemente wie Mo, Nb, V und Ta zugesetzt werden. Titanlegierungen werden häufig zur Herstellung biomedizinischer Materialien verwendet, insbesondere für solche, die Hartgewebe ersetzen. Die β-Phase von Titan weist einen erheblich niedrigen Elastizitätsmodul auf, was die mechanische Kompatibilität zwischen Implantat und Knochen erhöht. Der Elastizitätsmodul eines Implantats sollte so nah wie möglich an dem des Knochens liegen, um die Stress-Shielding-Wirkung3 zu verringern. Dies ist ein ernstes Problem, das zum Verlust der Knochenmasse (Osteopenie) und schließlich zum Versagen des Implantats führen kann. Die Elastizitätsmoduli häufig verwendeter Biomaterialien wie technisch reinem Titan oder Edelstahl können bis zu sechsmal höher sein als die von Knochen4. In den letzten Jahren wurden Titanlegierungen vom β-Typ, die auf dem quartären Ti-Nb-Zr-Ta-System basieren, aufgrund ihrer überlegenen Biokompatibilität und niedrigen Elastizitätsmodule für chirurgische Implantatanwendungen5 untersucht. Ein solches Material ist Ti-35Nb-7Zr-5Ta (TNZT), eine metastabile β-Titanlegierung mit einem niedrigen Elastizitätsmodul (ca. 60 GPa6,7), die frei von toxischen Elementen ist. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Fähigkeit des Implantats zur Osseointegration, also zur Bildung einer stabilen Fixierung mit dem Knochen. Wenn ein Implantat in den menschlichen Körper eingeführt wird, löst es eine Entzündungsreaktion aus, die mit der Einkapselung des Implantats durch Kollagenmoleküle endet. Diese Kapselbildung ist schwer zu vermeiden, aber Materialien auf Titanbasis weisen im Vergleich zu anderen biomedizinischen Metallen wie Edelstahl und Co-Cr-Legierungen2 eine minimale Einkapselung auf.

Trotz der Vorteile von Titan gegenüber anderen metallischen Biomaterialien sind weitere Fortschritte erforderlich, um die Osseointegration zu verbessern und die Abstoßungsrate des Implantats zu verringern. Da die Biokompatibilität von Implantaten eng mit der Oberflächenchemie und -topographie zusammenhängt, wurden Oberflächenmodifikationen von Titan ausführlich untersucht8,9, einschließlich des Wachstums von TiO2-Nanoröhren (TNTs)10 durch elektrochemische Anodisierung. Letzteres beinhaltet das Anlegen einer elektrischen Spannung zwischen dem Titan- oder Titanlegierungssubstrat (Anode) und einer Gegenelektrode (Kathode), getrennt durch einen fluoridhaltigen Elektrolyten. Die Bildung von TNTs während der Anodisierung ist auf eine Kombination gleichzeitiger Prozesse zurückzuführen, die als Konkurrenz zwischen dem feldunterstützten Wachstum der TiO2-Schicht und der chemischen Auflösung von TiO2 durch den fluoridhaltigen Elektrolyten zusammengefasst werden können, die vorzugsweise am Rohr auftritt Basis11. Während des anodischen Wachstums von TNTs können TiO2-Nanodrähte (TNWs) auf dem oberen Teil von TNTs durch einen Prozess der vertikalen Teilung von TNTs gebildet werden, der als „Bambusspaltungsmodell“12 bekannt ist. Die endgültige Nanostruktur besteht aus TNTs mit darüber liegenden TNWs, und die Länge der TNWs kann sogar länger sein als die der TNTs. Die für die Bildung von TNWs erforderlichen Anodisierungsparameter können je nach Zusammensetzung des Substrats (Anode) variieren, und die TNZT-Legierung begünstigt deren Bildung13. TNWs können auch durch andere Techniken wie Elektrospinnen, Laserablation und Oxidation synthetisiert werden14. Der Begriff TiO2-Nanofasern (TNFs) wird in der Literatur auch zur Beschreibung von TNWs-ähnlichen Strukturen verwendet. Obwohl der Unterschied zwischen diesen beiden Begriffen nicht klar ist, haben TNWs typischerweise Durchmesser in der Größenordnung von mehreren zehn Nanometern, während TNFs größere Durchmesser von bis zu 1 μm haben15. Sowohl TNWs als auch TNFs haben eine große Oberfläche, die die Zellanheftung und -proliferation unterstützen kann. Studien zur Biokompatibilität von Polymerfasergerüsten16 haben gezeigt, dass diese Art von Morphologie aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit der nativen extrazellulären Knochenmatrix eine günstige Umgebung für Zellen bietet. Darüber hinaus haben anodisch gewachsene TNWs den Vorteil, dass sie auch auf Implantaten mit komplexen Geometrien problemlos aufgewachsen werden können und da sie direkt aus dem Substrat wachsen, ist kein zusätzlicher Schritt zur Befestigung an der Implantatoberfläche erforderlich.

Zahlreiche Studien17 haben gezeigt, dass TNTs vielversprechende biomedizinische Materialien sind, die die Zellanhaftung und -proliferation gut unterstützen. Allerdings hat die Biokompatibilität von TNW- (oder TNF-)Beschichtungen in der Literatur wenig Beachtung gefunden; Welche Studien es gibt, weist viele Unterschiede in Methoden, Design und Ergebnissen auf und ist daher schwer zu vergleichen18,19,20,21,22. Diese Studien sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Darüber hinaus wurden in den meisten Studien zur Herstellung und Anwendung dieser TiO2-Nanostrukturen CP-Ti oder Ti-6Al-4V verwendet, die traditionellsten und am häufigsten verwendeten Legierungen. In der Zwischenzeit sollte den für biomedizinische Anwendungen entwickelten Niedrigmodul-Titanlegierungen vom β-Typ wie TNZT mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden. Zusätzlich zu ihrer verbesserten mechanischen Kompatibilität mit dem Knochen ist die TNZT-Legierung gegenüber CP-Ti für das anodische Wachstum von TiO2-Nanostrukturen vorteilhaft, da sie dreimal längere TNTs erzeugt und die Bildung von TNWs viel einfacher macht13. Nach unserem besten Wissen hat keine Studie das zelluläre Verhalten auf der Oberfläche von TNWs untersucht, die anodisch auf biomedizinischen Titanlegierungen vom β-Typ gezüchtet wurden. Daher zielte diese Studie darauf ab, die Biokompatibilität von TNWs zu untersuchen, die anodisch auf der TNZT-Legierung gezüchtet wurden, indem osteoblastische Vorläuferzellen auf ihren Oberflächen kultiviert wurden. Als Kontrollproben wurden TNT-beschichtete und flache TNZT-Oberflächen verwendet.

Die Legierung Ti-35Nb-7Zr-5Ta (Gew. %) wurde durch Voltaic-Lichtbogenschmelzen reiner Elemente in einem wassergekühlten Kupfertiegel unter einer Ar-Atmosphäre hergestellt. Der Barren wurde mindestens zehnmal umgeschmolzen und nach jedem Mal auf dem Tiegel gewendet, um die Homogenität sicherzustellen. Anschließend wurde es in einem mit Ar gefüllten Quarzglasrohr eingekapselt und 24 Stunden lang bei 1000 °C homogenisiert, um die Mikrosegregation der Elemente zu beseitigen. Anschließend wurde der Barren in mehreren Durchgängen kaltgewalzt, um die Dicke um etwa 75 % zu reduzieren, was zu einer Platte mit einer Dicke von 2 mm führte. Anschließend wurde die Platte 1 Stunde lang unter einer Ar-Atmosphäre bei 800 °C (über der β-Transus-Temperatur) getempert und anschließend mit Wasser abgeschreckt.

Die TNZT-Legierungsplatte wurde zur Synthese von TNWs durch elektrochemische Anodisierung in Stücke von etwa 15 × 15 mm geschnitten. Die Oberflächen der Proben wurden durch Schleifen mit Schleifpapier bis zu einer Körnung von 1200 vorbereitet und 10 s lang in einer Säurelösung aus HF und HNO3 (1:1) chemisch poliert. Die Anodisierung erfolgte in einer Elektrolysezelle mit einem Fassungsvermögen von ca. 100 ml (50 mm Durchmesser und 50 mm Höhe) unter Verwendung eines Platinnetzes von 30 × 30 mm als Kathode. Die TNZT-Probe, die die Anode des Systems darstellte, stand durch ein rundes Fenster mit 8 mm Durchmesser, das sich auf halber Zellhöhe befand, mit der Elektrolytlösung in Kontakt. Anode und Kathode wurden an ein Netzteil (Elektro-Automatik 8200–70, Viersen, Deutschland) angeschlossen, das im Dauerspannungsmodus arbeitete. Der Elektrolyt wurde während der Anodisierung kontinuierlich mit einem Magnetrührstab gerührt. Die verwendeten Anodisierungsparameter basierten auf einer früheren Studie13. Um TNWs zu züchten, wurde ein organischer Elektrolyt, der Ethylenglykol mit 0,5 Gew.-% NH4F und 10 Vol.-% Wasser enthielt, verwendet und 12 Stunden lang eine Spannung von 20 V angelegt. Unmittelbar nach der Anodisierung wurden die Proben mit entionisiertem Wasser gespült.

Als Kontrolloberflächen wurden TNT-beschichtete und flache TNZT-Proben verwendet. Obwohl TNTs und TNWs sehr unterschiedliche Morphologien aufweisen, können beide durch einen ähnlichen Anodisierungsprozess synthetisiert werden, und das Erhalten des einen oder anderen hängt nur von den verwendeten Parametern ab. TNT-Proben wurden als Kontrolle ausgewählt, da TNTs bereits ausführlich untersucht wurden und bekanntermaßen eine ausgezeichnete Biokompatibilität aufweisen10. In Anbetracht der Tatsache, dass TNTs einfacher und schneller zu erhalten sind13, wäre die Verwendung von eloxierten TNWs als Biomaterial nur dann gerechtfertigt, wenn ihre Biokompatibilität überlegen wäre oder wenn sie einen anderen Vorteil gegenüber den TNTs hätten.

Die TNTs wurden mit einem ähnlichen Verfahren wie für das Wachstum von TNWs synthetisiert, mit der Ausnahme, dass andere Anodisierungsparameter gewählt wurden. Anstelle des organischen Elektrolyten wurde ein wässriger Elektrolyt mit 0,3 Vol.-% HF verwendet und 1 h lang eine Spannung von 20 V angelegt. Der wässrige Elektrolyt begrenzt die Dicke der TiO2-Schicht und verhindert die Bildung von TNWs13. Die flachen Proben wurden hergestellt, indem die TNZT-Platten mit Schleifpapier bis zu einer Körnung von 1200 geschliffen und 10 s lang in einer Säurelösung aus HF und HNO3 (1:1) chemisch poliert wurden.

Die Benetzbarkeit der TNW-, TNT- und flachen TNZT-Oberflächen wurde durch Messung des Kontaktwinkels zwischen einem Wassertropfen und der Probenoberfläche gemäß den in der Norm ASTM D7334-0823 beschriebenen Richtlinien bewertet. Vor der Messung des Kontaktwinkels wurden drei verschiedene Trocknungsverfahren angewendet: (i) Trocknen mit N2-Strom für etwa zwei Minuten, (ii) Trocknen unter Vakuum und (iii) Eintauchen in entionisiertes Wasser für 24 Stunden, gefolgt von Vakuumtrocknung. Mit einer vertikal fixierten Mikropipette wurden 5 μl entionisiertes Wasser vorsichtig auf die Probenoberfläche aufgetragen. Die Form des Wassertropfens wurde mit einer tragbaren digitalen Mikroskopkamera aufgezeichnet. Der Kontaktwinkel zwischen dem Wassertropfen und der Oberfläche wurde mit dem Kontaktwinkel-Plugin für die ImageJ-Software24 und mindestens drei Proben für jede Bedingung gemessen.

Die MC3T3-E1-Osteoblastenvorläuferzelllinie wurde von Sigma-Aldrich (ECACC, Kat.-Nr. 99072810) erhalten und in essentiellem Alpha-Minimummedium (α-MEM; Pan Biotech), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Sigma-Aldrich), gehalten. und Penicillin/Streptomycin (Dominique Dutcher) bei 37 °C und 5 % CO2, wobei das Medium alle 2 Tage gewechselt wurde. Als die Zellen konfluent wurden, wurden sie abgetrennt und mit 0,25 % Trypsin (Dominique Dutcher) passagiert. Vor der Zellkultur wurden alle Proben 1 Stunde lang mit Ethanol (70 %) sterilisiert, gefolgt von 20-minütigem Waschen mit Wasser und ultravioletter (UV) Strahlung. Die Einwirkung von UV-Strahlung auf die TiO2-Oberflächen könnte prinzipiell ihre Benetzbarkeit verändern, diese Änderung wird jedoch umgekehrt, wenn Proben während der Zellkultur in die wässrige Umgebung eingetaucht werden. Für Biokompatibilitätsexperimente wurden 80 µl vollständiges α-MEM mit 6000 Zellen auf die flachen TNZT-, TNT- und TNW-Oberflächen gelegt. Nach 3-stündiger Inkubation wurden 3 ml des Mediums in die Petrischalen (35 mm) mit den Proben gegeben.

Die Zellproliferation wurde durch Messung der Calceinacetoxymethylester-Aufnahme alle 24 Stunden geschätzt. In lebenden Zellen wurde das nichtfluoreszierende Calcein nach der Hydrolyse von Acetoxymethylester durch intrazelluläre Esterasen in grün fluoreszierendes Calcein umgewandelt. Kurz gesagt, die Zellen wurden 30 Minuten lang bei 37 ° C mit 3 μM Calcein AM (Molecular Probes, Life Technologies) inkubiert, dann mit HBSS (Gibco) gewaschen und unter einem Nikon Eclipse 90i-Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Mindestens fünf zufällig ausgewählte Felder wurden pro Versuchsbedingung mit einer Nikon DXM 1200F-Kamera erfasst und analysiert. Um die Anzahl der Calcein-positiven Zellen abzuschätzen, wurden die gesamten fluoreszierenden Pixel pro Feld gezählt, wobei der Hintergrund für alle Bilder zuvor angepasst wurde. Für die Analyse wurde die ImageJ-Softwareversion 1.51j8 (National Institutes of Health, MD, USA) verwendet.

Für den MTT-Assay (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) wurden die Zellen bei 37 °C mit 0,5 mg/ml MTT-Reagenz (Sigma-Aldrich) inkubiert. Nach 2 Stunden wurden jeder Kulturplatte 2 ml 2-Propanol zugesetzt und die Absorption bei 560 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (Thermo Multiskan Ex) gemessen. MTT-Messungen wurden 1, 3 und 5 Tage nach der Ausplattierung der Zellen durchgeführt.

Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt und die Daten wurden mit der GraphPad Prism-Softwareversion 7.04 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) analysiert. Calcein-positive Pixel und die MTT-Analyse wurden zwischen den Gruppen im Laufe der Zeit mithilfe einer Zwei-Wege-Varianzanalyse verglichen, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test.

Die Zellmorphologie wurde mittels SEM (Hitachi S-3000N) mit einer Beschleunigungsspannung von 0,3 bis 30 kV beobachtet. Vor der Charakterisierung durch SEM wurden Zellen 48 Stunden lang auf den Oberflächen der TNW- und Kontrollproben kultiviert. Anschließend wurden die Zellen fixiert, dehydriert, getrocknet und mit Gold beschichtet. Der Fixierungsprozess begann mit vier aufeinanderfolgenden Wäschen mit Cacodylatpuffer (pH 7,4) für 15 Minuten, einer Fixierung mit 2 % Glutaraldehyd in Cacodylatpuffer für 1 Stunde und einer Fixierung mit 1 % Osmiumtetroxid in Cacodylatpuffer für 2,5 Stunden. Nach fünf Wäschen mit destilliertem H2O wurden die Proben zur Dehydrierung 1 Stunde lang im Dunkeln mit 1 % Tannin inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit zunehmenden Ethanolkonzentrationen (70 %, 80 %, 90 %, 96 % und 100 %) jeweils 10 Minuten lang dehydriert und mit drei Lösungen von Hexamethyldisilazan (HMDS) in den folgenden Anteilen getrocknet: ein Teil HMDS + zwei Teile 100 %iger Alkohol (20 Min.); gleiche Teile HMDS und 100 % Alkohol (20 Min.); und drei Teile HMDS + ein Teil 100 %iger Alkohol (20 Min.). Abschließend wurden die drei Proben mithilfe eines Sputtermetallisierungssystems Q150T-S (Quorum Technologies) mit einer dünnen Au-Schicht beschichtet.

Die Analyse der Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) wurde mit einem Spektrometer der physikalischen Elektronik (PHI Versa Probe II Scanning XPS Microprobe) unter Verwendung monochromatischer Strahlung Al Kα (1486,6 eV, 100 μm, 100 W, 20 kV) als Anregungsquelle und einer Dualquelle durchgeführt -Strahlladungsneutralisator. Die hochauflösenden Spektren wurden mit einer Durchgangsenergie von 29,35 eV und einem Röntgenstrahldurchmesser von 100 mm aufgenommen. Zur Indizierung der XPS-Spektren wurde die NIST-Standardreferenzdatenbank25 verwendet. Die Röntgenbeugungsanalyse (XRD) (2q-Scans) wurde mit einem Panalytical X'Pert Pro-Diffraktometer unter Verwendung von Cu-ka-Strahlung (Wellenlänge = 1,5406 Å) durchgeführt.

Eine XRD-Analyse der TNZT-Legierung, die als Substrat für das anodische Wachstum von TNTs und TNWs verwendet wird, wurde durchgeführt, um zu bestätigen, ob die Proben die erwartete Phasenzusammensetzung aufweisen. Abbildung 1 zeigt das erhaltene Muster. Alle in der Abbildung sichtbaren Reflexionen stammen von der kubisch-raumzentrierten Phase (β) von Titan (Powder Diffraction File-Datenbank – PDF-Nummer 01-071-9955), wie für diese Legierung erwartet.

XRD-Analyse der TNZT-Legierung, die als Substrat für das anodische Wachstum von TNTs und TNWs verwendet wird. Alle beobachteten Reflexionen stammen von der kubisch-raumzentrierten (β) Phase von Titan.

Die Anodisierung der TNZT-Proben im organischen Elektrolyten wurde 12 Stunden lang bei 20 V durchgeführt und führte dazu, dass die gesamte Oberfläche dicht mit TNWs bedeckt war, wie in Abb. 2a dargestellt. Die TNWs schienen sehr flexibel zu sein und wurden in Clustern gruppiert, wie auch in einer früheren Studie beobachtet wurde13. Die TNWs wuchsen auf TNTs, wie in Abb. 2b zu sehen ist, in Übereinstimmung mit dem von Lim und Choi vorgeschlagenen Bambusspaltungsmodell12. Die TNTs hatten eine Länge von etwa 4,6 μm und einen Durchmesser von 80 nm. Abbildung 2c zeigt ein stärker vergrößertes Bild der TNWs und zeigt ihr Wachstum aus den TNT-Wänden. Die genaue Länge der TNWs war aufgrund ihrer verworrenen Morphologie schwer zu messen, aber sie schienen die gleiche Länge wie die TNTs zu haben. Der durchschnittliche Durchmesser der Nanodrähte betrug etwa 28 nm.

FEG-REM-Aufnahmen einer TNZT-Probe, die 12 Stunden lang im organischen Elektrolyten bei 20 V anodisiert wurde, was zur Bildung von TNWs auf der Oberseite führte. (a) Draufsichtbild, (b) Schrägansichtsbild und (c) Draufsichtbild mit höherer Vergrößerung.

Die TNT-beschichteten Proben wurden durch einstündiges Anodisieren der TNZT-Legierung mit dem wässrigen Elektrolyten bei 20 V erhalten. Es wurden TNTs mit einer relativ einheitlichen Morphologie mit dünnen Wänden und gut geöffneten Mündern erzeugt (Abb. 3a). Die unter diesen Anodisierungsbedingungen gebildeten Nanoröhren konnten anhand ihrer Größe in zwei Gruppen eingeteilt werden, wie in einer früheren Studie beobachtet wurde13. Die Nanoröhren der ersten Gruppe waren länger und breiter, mit einer durchschnittlichen Länge von 1,65 μm und einem Durchmesser von etwa 109 nm. Die Nanoröhren der zweiten Gruppe umgaben die Nanoröhren der ersten Gruppe (Abb. 3b) und hatten eine Länge von etwa 1,1 μm und einen Durchmesser von 76 nm. Der Längenunterschied zwischen den beiden Gruppen war in einem Seitenansichtsbild besser sichtbar (Abb. 3c).

FEG-SEM-Aufnahmen einer TNZT-Probe, die 1 Stunde lang bei 20 V im wässrigen Elektrolyten anodisiert wurde. (a,b) Draufsicht- und (c) Seitenansichtsbilder.

Tabelle 2 gibt einen Überblick über die verwendeten Anodisierungsparameter und die daraus resultierenden Morphologien.

Abbildung 4 zeigt die XPS-Analysen für die TNT- und TNW-Proben. Das Untersuchungsspektrum (niedrige Auflösung) (Abb. 4a) zeigt erwartungsgemäß das Vorhandensein von Ti-, Nb-, Zr-, Ta- und O-Elementen. Die hochauflösenden Spektren von Ti, Nb, Zr, Ta und O (Abb. 4b–f) weisen auf das Vorhandensein von TiO2-, Nb2O5-, Ta2O5- und ZrO2-Oxiden hin (NIST-Standardreferenzdatenbank25). Die Bindungsenergiekurven für beide Proben sind ähnlich. Tabelle 3 zeigt die aus der XPS-Analyse erhaltene Gewichtsprozent-Elementzusammensetzung. Obwohl für die Synthese der TNTs und TNWs unterschiedliche Elektrolyte und Anodisierungszeiten verwendet wurden, ist ihre chemische Zusammensetzung sehr ähnlich, sodass nicht zu erwarten ist, dass sie die Biokompatibilität beeinflussen würde.

XPS-Analysen für die TNTs (Anodisierung im wässrigen Elektrolyten) (blaue Linie) und TNWs (Anodisierung im organischen Elektrolyten) (rote Linie). (a) Vollständiges Übersichtsspektrum und hochauflösende Spektren von (b) Ti 2p, (c) Nb 3d, (d) Zr 3d, (e) Ta 4f und (f) O 1s.

Die Osteoblasten-Vorläuferzelllinie MC3T3-E1 wurde auf den Oberflächen von TNW- und Kontrollproben (TNT und flaches TNZT) kultiviert. Die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen wurde 5 Tage lang alle 24 Stunden mittels Fluoreszenzmikroskopie bewertet. Abbildung 5 zeigt ein repräsentatives Bild von Calcein-positiven Zellen für jede Probenoberfläche und jeden ausgewerteten Zeitpunkt. Eine erste Analyse ergab, dass die Zellen an den drei Oberflächen anhafteten und sich vermehrten. Wie die Abbildung zeigt, wiesen die auf den Oberflächen der flachen TNZT- und TNT-Proben gewachsenen Zellen hohe Proliferationsraten auf und waren nach 5 Tagen in Kultur vollständig konfluent. Allerdings zeigten die auf der TNW-Oberfläche gewachsenen Zellen eine deutlich geringere Proliferationsrate mit deutlich geringeren Zellzahlen im Zeitverlauf als auf den Flach- und TNT-Oberflächen. Um die Zellproliferation zu quantifizieren, haben wir die Fluoreszenzintensität in den mikroskopischen Bildern geschätzt, indem wir die Anzahl der grünen Pixel pro Bild unter experimentellen Bedingungen gezählt haben (Abb. 6a). Die Ergebnisse zeigten eine ähnliche Anzahl grüner Pixel für die flachen und TNT-Proben, ohne signifikante Unterschiede. Allerdings war die Anzahl der Pixel bei der TNW-Probe zu allen ausgewerteten Zeitpunkten deutlich geringer und etwa 49 % niedriger als bei den anderen beiden Proben nach 5 Tagen in Kultur. Darüber hinaus wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch den MTT-Assay nach 1, 3 und 5 Tagen in Kultur bewertet (Abb. 6b). Obwohl die Unterschiede statistisch nicht signifikant waren, zeigten die Ergebnisse die gleiche allgemeine Tendenz wie die mit der Pixelzählmethode erhaltenen Ergebnisse, was darauf hindeutet, dass die TNW-Probe nach 5 Tagen in Kultur eine geringere Anzahl lebensfähiger Zellen aufweist als die anderen beiden Oberflächen.

Fluoreszenzmikroskopische Bilder von Calcein-gefärbten MC3T3-E1-Zellen an den Tagen 1 bis 5 der Kultur auf den Oberflächen des chemisch polierten Materials, TNTs und TNWs.

Proliferation und Lebensfähigkeit von MC3T3-E1-Zellen nach unterschiedlichen Kulturzeiten auf den Oberflächen der TNW- und Kontrollproben (flaches TNZT und TNT), bewertet durch Fluoreszenzmikroskopie (a) und durch den MTT-Assay (b). Die Werte stellen den Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten dar. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001 vs. flache TNZT-Proben (zweiseitige Varianzanalyse, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test).

Um die Morphologie der Zellen auf den Oberflächen der verschiedenen Proben genauer zu beobachten, wurde nach 48 Stunden Kultur eine SEM durchgeführt. Abbildung 7 zeigt Bilder der Zellen auf der TNW-Oberfläche sowie auf den Kontrollproben (flaches TNZT und TNT) in geringer Vergrößerung. Ähnlich wie bei den Fluoreszenzmikroskopiebildern wiesen die flachen und TNT-Proben (Abb. 7a, b) eine hohe Zelldichte auf, die die Oberflächen fast vollständig bedeckte. Im Gegensatz dazu zeigte die TNW-Probe (Abb. 7c) eine deutlich geringere Zellzahl. Abbildung 8 zeigt stärker vergrößerte Bilder der Zellen auf der Oberfläche der flachen TNZT-, TNT- und TNW-Proben. Auf TNW-Proben ausgesäte Zellen scheinen eine länglichere Morphologie und Filopodien aufzuweisen; Zukünftige immunhistochemische Studien, z. B. Aktin/Vinculin, werden jedoch dabei helfen, den Einfluss zu bestimmen, den die verschiedenen Oberflächen auf die Dynamik des Zytoskeletts haben könnten. Darüber hinaus können in den REM-Bildern TNWs auf der Oberfläche beobachtet werden, ohne dass erkennbare Schäden vorliegen, die die Zelladhäsion und -proliferation beeinträchtigen könnten.

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von MC3T3-E1-Zellen nach 48-stündiger Kultur auf den Oberflächen der (a) flachen TNZT-, (b) TNT- und (c) TNW-Proben.

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von MC3T3-E1-Zellen nach 48-stündiger Kultur. (a) Flaches TNZT, (b) TNTs und (c) TNWs.

Eine der wichtigen Eigenschaften der Biomaterialien, die die beobachteten Unterschiede bei der Zellproliferation in Kultur erklären könnte, ist die Benetzbarkeit der Oberfläche, die sich auf deren Biokompatibilität auswirken kann. Die Kontaktwinkelmessung ist die gebräuchlichste Methode zur Beurteilung der Benetzbarkeit. Abbildung 9 zeigt die Ergebnisse der Kontaktwinkelmessungen für die flachen TNZT-, TNT- und TNW-Proben (je niedriger der Kontaktwinkel, desto höher die Benetzbarkeit). Der Kontaktwinkel für die flachen TNZT- und TNT-Oberflächen betrug etwa 86° bzw. 75°. Die Benetzbarkeit der TNWs wurde durch die Trocknungsmethode nach der Anodisierung beeinflusst. Das Trocknen mit einem N2-Strom, eine übliche Methode zum Trocknen anodisierter TNTs, führte zu einem relativ niedrigen Kontaktwinkel von etwa 19°. Die in dieser Studie erhaltenen TNWs sind lang und dicht, was möglicherweise schwieriger zu trocknen ist, was Zweifel daran aufkommen ließ, ob der N2-Fluss ausreichte, um alles Wasser zu entfernen, das möglicherweise in der Nanostruktur eingeschlossen war. Um dies zu klären, wurden einige TNW-Proben 24 Stunden lang unter Vakuum getrocknet, was zu einem deutlich höheren Kontaktwinkel von etwa 63° führte. Daher war der Vakuumtrocknungsschritt vor der Kontaktwinkelmessung für eine korrekte Messung unerlässlich. Darüber hinaus wurden einige Proben vor dem Trocknen 24 Stunden lang in Wasser getaucht, um die wässrige Umgebung zu simulieren, der die Proben während der Osteoblasten-Zellkultur ausgesetzt sind. Dieses Eintauchen in Wasser hatte keinen wesentlichen Einfluss auf die Benetzbarkeit, was zu einem Kontaktwinkel von etwa 57° führte.

Messungen der Benetzbarkeit (Kontaktwinkel) der flachen TNZT-, TNT- und TNW-Oberflächen. Der Einfluss der Trocknungsmethode nach der Anodisierung für die TNW-Proben wird gezeigt.

Die höhere Benetzbarkeit der TNTs im Vergleich zu der der flachen Oberfläche wurde aufgrund des Kapillareffekts erwartet10, obwohl die Benetzbarkeit je nach Nanoröhrenmorphologie und Anodisierungsparametern erheblich variieren kann10,26,27. Bisher wurde keine Studie zur Benetzbarkeit anodischer TNWs durchgeführt, ihre hohe Oberflächenrauheit und Durchlässigkeit könnte jedoch ihre deutlich höhere Benetzbarkeit erklären. Die Übersicht von Menzies und Jones28 über den Einfluss des Kontaktwinkels auf die Biokompatibilität von Biomaterialien kam zu dem Schluss, dass eine hydrophobe Oberfläche zwar bekanntermaßen die Biokompatibilität verringert, eine stark hydrophile Oberfläche jedoch auch schädlich sein könnte, da sie Zell-Zell-Wechselwirkungen verhindert. Lee et al.29 untersuchten das Verhalten von Zellen auf einer Oberfläche mit einem Benetzbarkeitsgradienten (Kontaktwinkel zwischen 30° und 90°) und stellten fest, dass die Zellen bei 50° die beste Haftung zeigten. Es scheint, dass es einen mittleren Kontaktwinkel (nicht zu niedrig oder zu hoch) gibt, der optimal wäre. Obwohl die Benetzbarkeit der TNW-Oberfläche einen guten Wert darzustellen scheint, sind andere Faktoren wahrscheinlich von größerer Bedeutung für ihre Biokompatibilität.

MC3T3-E1-Zellen zeigten eine ähnliche Proliferation auf den Oberflächen der flachen TNZT- und TNT-Proben, was darauf hinweist, dass beide Kontrollproben eine gute Biokompatibilität aufwiesen. Die starke Proliferation auf der TNT-Oberfläche wurde aufgrund der Daten anderer Studien erwartet17, und eine ähnliche Zellproliferation auf den Oberflächen von TNTs und flachem Ti wurde auch von Chang et al.22 beobachtet. Wie in der Einleitung erwähnt, haben nur wenige Studien die Aktivität von Knochenzellen auf mit TNWs oder TNFs bedeckten Oberflächen untersucht (Tabelle 1). Obwohl einige dieser Studien eine stärkere Proliferation von Zellen auf den Oberflächen von TNWs im Vergleich zu denen auf flachen Oberflächen zeigten, wurde in vier der sechs in Tabelle 1 aufgeführten Studien eine verringerte oder ähnliche Proliferation beobachtet. Die Synthesemethoden sowie die Morphologie und Die Abmessungen der Nanostrukturen variierten in diesen Studien stark.

Es wird erwartet, dass die Oberflächentopographie und -morphologie die Biokompatibilität der TNWs beeinflussen. Es wurde berichtet, dass der Nanodraht-/Nanofaserdurchmesser und die Porengröße die Zellreaktion beeinflussen. Badami et al.30 untersuchten die Proliferation und Differenzierung von MC3T3-E1-Zellen auf Polymerfasern mit Durchmessern im Bereich von etwa 140 nm bis 2,1 μm und beobachteten, dass die kleineren Faserdurchmesser zu einer geringeren Zelldichte führten und die Zellinfiltration in die Fasern verhinderten. Die Infiltration ist ein wesentlicher Parameter für die Knochenbildung, da Zellen in die Knochenmatrixproteine ​​eindringen und diese produzieren16. Die Durchmesser von TNWs/TNFs, die durch Elektrospinnen18,19, thermische Oxidation20 und Atomlagenabscheidung21 erhalten wurden, waren deutlich größer als die der TNWs, die in dieser Studie oder in anderen Studien erhalten wurden, die elektrochemische Anodisierung als Synthesemethode verwendeten. Ein weiterer entscheidender Unterschied besteht darin, dass anodisch gewachsene Nanodrähte viel dichter sind und praktisch keine Poren oder freien Raum aufweisen.

TNWs und TNFs können mit verschiedenen Methoden synthetisiert werden und ihre Abmessungen und Morphologien können je nach Methode und verwendeten Parametern erheblich variieren. Die Zahl der Studien zur Proliferation osteoblastischer Zellen auf der Oberfläche dieser Nanostrukturen ist noch sehr begrenzt und die Ergebnisse sind nicht schlüssig. Obwohl einige Studien darauf hinweisen, dass die Verwendung von TNWs/TNFs für biomedizinische Anwendungen vielversprechend ist, müssen die Parameter, die die Zellproliferation beeinflussen, besser verstanden werden. Darüber hinaus bieten die langen TNWs, die durch elektrochemische Anodisierung der TNZT-Legierung erhalten werden, eine sehr hohe spezifische Oberfläche, die für andere potenzielle Anwendungen wie Katalyse31, Biosensoren32 und Arzneimittelabgabesysteme33 von Vorteil sein könnte.

Ein weiterer Sicherheitsaspekt, der beachtet werden muss, ist die mögliche Beschädigung implantierter TiO2-Nanostrukturen. Implantate sind häufig tribologischen Bedingungen ausgesetzt, die zur Freisetzung fester Ablagerungen und zu periimplantären Entzündungsreaktionen führen können. Wie in „Einführung“ erläutert, entstehen anodisch gewachsene TNWs durch die vertikale Spaltung von TNTs während der Anodisierung, was zu einer dualen Morphologie führt, die aus Nanoröhren mit Nanodrähten oben besteht. Diese Nanostruktur muss vor Bruch oder Ablösung vom Substrat geschützt werden. Für die TNTs liegen einige Studien zur mechanischen Stabilität vor. Vielversprechende Ergebnisse wurden von Shivaram et al.34 gefunden, die eine Ex-vivo-Implantation von mit TNTs bedecktem Titan durchführten und bei TNTs mit einer Länge von bis zu 1 mm keine signifikanten Schäden beobachteten. Die Scherfestigkeit von TNT-Beschichtungen wurde von Cao et al. untersucht35 und sie beobachteten, dass die Haftung am Substrat bei kürzeren TNTs höher ist. In der Literatur wurde keine Studie zur mechanischen Stabilität anodischer TNWs gefunden, ein Thema, das in Zukunft behandelt werden muss. Der Durchmesser anodischer TNWs ist erheblich dünner als der von TNWs, die durch andere Synthesemethoden hergestellt werden (Tabelle 2), was ihnen aufgrund der geringeren Spannung bei einem gegebenen Radius eine große Flexibilität verleiht (wie aus der Morphologie in Abb. 1 hervorgeht). Krümmung. Diese Flexibilität könnte möglicherweise dazu beitragen, mechanische Schäden zu vermeiden.

Diese Studie untersuchte die Lebensfähigkeit und Proliferation von MC3T3-E1-Osteoblasten-Vorläuferzellen auf der Oberfläche von TNWs, die durch elektrochemische Anodisierung auf der TNZT-Legierung gezüchtet wurden. Als Kontrollproben wurden TNT-beschichtetes und flaches TNZT verwendet. Es wurde bestätigt, dass die TNZT-Legierung ein geeignetes Substrat für das Wachstum von TNWs ist und das Wachstum langer TiO2-Nanostrukturen ermöglicht. Die MC3T3-E1-Zellproliferation auf den flachen TNZT- und TNT-Oberflächen war ähnlich und relativ hoch. Die Zellproliferation der TNW-Probe war nach 5 Tagen Kultur mindestens etwa 25 % geringer als die der Kontrollproben. Obwohl beobachtet wurde, dass die Zellen in der TNW-Probe eine geringere Stoffwechselaktivität aufwiesen, waren diese Unterschiede statistisch nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass das Zellüberleben unter den drei verschiedenen Versuchsbedingungen ähnlich war. Die TNWs zeigten ein moderates Maß an Hydrophilie, während die Benetzbarkeit der Kontrollproben deutlich höher war. Dies sollte im Prinzip eine verbesserte Biokompatibilität für die TNW-Oberfläche darstellen; Möglicherweise spielen jedoch auch andere Faktoren eine wichtigere Rolle, beispielsweise die Oberflächentopographie und die TNW-Morphologie. Weitere Studien sind erforderlich, um alle Parameter zu verstehen, die die Proliferation osteoblastischer Zellen auf der Oberfläche von TNWs und anderen ähnlichen Nanostrukturen beeinflussen. Die in dieser Studie erhaltenen langen TNWs weisen ein hohes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen auf, das auch für andere Anwendungen nützlich sein kann.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind im ZENODO-Repository verfügbar, https://doi.org/10.5281/zenodo.6345229.

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Diese Arbeit wurde von der brasilianischen Forschungsförderungsagentur FAPESP (São Paulo Research Foundation) [Fördernummer 2019/01760-5] unterstützt; die spanische staatliche Forschungsagentur (AEI) und das spanische Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten im Rahmen des Projekts CALYPSOL-ATECWATER [Fördernummer RTI2018-097997-B-C33]; und Comunidad de Madrid durch das Programm REMTAVARES [Zuschussnummer P2018/EMT-4341].

Fakultät für Maschinenbau, Universität Campinas (Unicamp), Rua Mendeleyev, 200, Campinas, São Paulo, 13083-860, Brasilien

Leonardo Fanton

Abteilung für Chemie- und Umwelttechnologie, König-Juan-Carlos-Universität, C/ Tulip S/N, Mostoles, 28933, Madrid, Spanien

Leonardo Fanton, Cristina Adán, Rafael A. García-Muñoz und Javier Marugán

Forschungsunterstützungslabor, Fundación Alcorcón University Hospital, C/ Budapest 1, Alcorcón, 28922, Madrid, Spanien

Frida Loria, Mario Amores & M. Ruth Pazos

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LF entwarf die Studie, führte einen Teil der experimentellen Arbeit durch und verfasste das Hauptmanuskript. FL, MA und MRP führten die Biokompatibilitätsexperimente durch und interpretierten sie, diskutierten die Ergebnisse und verfassten einen Teil des Manuskripts. CA überwachte die Studie, bereitete die Proben vor, analysierte die Ergebnisse und verfasste einen Teil des Manuskripts. RAG beteiligte sich an der Konzeptualisierung der Studie und der Diskussion der Ergebnisse. JM war der Hauptbetreuer, entwarf die Studie, analysierte die Ergebnisse und beteiligte sich am Schreibprozess. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Javier Marugán.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Fanton, L., Loria, F., Amores, M. et al. Proliferation von Osteoblasten-Vorläuferzellen auf der Oberfläche von TiO2-Nanodrähten, die anodisch auf einer biomedizinischen Titanlegierung vom β-Typ gewachsen sind. Sci Rep 12, 7895 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11981-4

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Eingegangen: 05. März 2022

Angenommen: 04. Mai 2022

Veröffentlicht: 12. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11981-4

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