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Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21413 (2022) Diesen Artikel zitieren

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In dieser Arbeit demonstrieren wir die Entwicklung eines schnellen und markierungsfreien elektrochemischen Biosensors zum Nachweis von Listeria monocytogenes unter Verwendung eines neuartigen Stimulus-Reaktions-Thiomer-Nanobürstenmaterials. Nanobürsten wurden durch gleichzeitige einstufige Abscheidung von Nanoplatin (Pt) und Alginat-Thiomeren (ALG-Thiomer) entwickelt. Die ALG-Thiomer/Pt-Nanobürstenplattform erhöhte die durchschnittliche elektroaktive Oberfläche der Elektroden deutlich um das Siebenfache und behielt die Aktivierungseigenschaften (pH-stimulierte osmotische Schwellung) des Alginats bei. Das dielektrische Verhalten während der Bürstenbetätigung wurde mit positiv, neutral und negativ geladenen Redoxsonden oberhalb und unterhalb des isoelektrischen Punktes von Alginat charakterisiert, was darauf hindeutet, dass die Oberflächenladung des ALG-Thiomers eine wichtige Rolle bei der Signalerfassung spielt. Für Biosensoranwendungen wurde die ALG-Thiomer-Plattform mit einem Aptamer biofunktionalisiert, das für das Internalin-A-Protein auf Listerien selektiv ist. Die Aptamerbeladung wurde optimiert und verschiedene Strategien zur Zellerfassung wurden untersucht (Bürste ausgefahren versus kollabiert). Die maximale Zellerfassung erfolgt, wenn sich das ALG-Thiomer/Aptamer in der erweiterten Konformation befindet (pH > 3,5), gefolgt von einer Impedanzmessung in der kollabierten Konformation (pH < 3,5). In einer komplexen Lebensmittelmatrix (Hühnerbrühe) wurden geringe Bakterienkonzentrationen (5 KBE ml−1) nachgewiesen, und Selektivitätstests gegen andere grampositive Bakterien (Staphylococcus aureus) zeigen, dass die Aptameraffinität auch bei diesen pH-Werten erhalten bleibt. Das neue hybride weiche Material gehört zu den effizientesten und schnellsten (17 Minuten) für die L. monocytogenes-Biosensorik, die es bisher gab, und erfordert keine Probenvorbehandlung, was eine vielversprechende neue Materialplattform für die Erkennung kleiner Moleküle oder Zellen darstellt.

Listeria monocytogenes ist ein virulentes, in der Umwelt (Boden und Wasser) allgegenwärtiges, lebensmittelübertragendes Bakterium, das in den USA jährlich Hunderte von Todesfällen verursacht1,2. Jedes Jahr werden fast 48 Millionen Fälle von lebensmittelbedingten Krankheiten gemeldet, von denen fast 19 % auf eine Infektion mit Listeria monocytogenes zurückzuführen sind und möglicherweise negative wirtschaftliche Auswirkungen in Höhe von 15 Milliarden US-Dollar aufgrund von Gesundheitskosten, Produktivitätsverlusten und Todesfällen haben3,4. Mit Symptomen wie Muskelschmerzen, Übelkeit, Durchfall, Erbrechen und Schüttelfrost1 gehört L. monocytogenes zu den tödlichsten lebensmittelbedingten Krankheitserregern, mit einer Todesrate von bis zu 30 % bei Hochrisikopersonen5,6. Besonders gefährlich ist es für schwangere Frauen, die sich zwar im Allgemeinen erholen, ihre Babys jedoch möglicherweise nicht überleben2.

Listeria monocytogenes ist in Lebensmittelverarbeitungsumgebungen ein schwer zu überwachender Krankheitserreger, da er sich bei niedrigem Feuchtigkeitsgehalt, hohem Salzgehalt oder bei Temperaturen, die mit herkömmlichen Kühl-/Gefriereinheiten verbunden sind, vermehren kann7. Eine Null-Toleranz-Regel für L. monocytogenes in verzehrfertigen Lebensmitteln wurde von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA), dem US-Landwirtschaftsministerium (USDA) und der Europäischen Union (EU)1 in Verbindung mit dem eingeführt Die zunehmende Zahl von Lebensmittelrückrufen im Zusammenhang mit einer Kontamination mit Listerien in den letzten Jahren8 verstärkt den Bedarf an Methoden zum Nachweis von Krankheitserregern in Echtzeit, mit denen kontaminierte Lebensmittel identifiziert werden können, bevor sie an die Öffentlichkeit gelangen.

Der aktuelle Stand der Technik zum Nachweis von Listerien in Lebensmittelverarbeitungsbetrieben, einschließlich Total Viable Counts (TVC), ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assays) und PCR (Polymerase-Kettenreaktion), ist anfällig für Fehler und falsche Messwerte. und erfordern kostspielige Laboreinrichtungen mit hochqualifiziertem Personal9,10. Die Testergebnisse dieser Methoden verzögern sich erheblich, da zwei aufeinanderfolgende Anreicherungsschritte (bis zu 48 Stunden) erforderlich sind, um die Bakterien vor einem qualitativen Nachweisschritt zu konzentrieren/verstärken11, da diesen Methoden die Empfindlichkeit fehlt [~ 100 KBE mL-1 Nachweisgrenze (LOD)]. ]12,13 und kann geringe Mengen an Krankheitserregern in komplexen Proben wie Medien, Brühe oder homogenisiertem Gewebe nicht direkt nachweisen.

Elektrochemische Sensortechniken werden aufgrund ihrer inhärenten Vorteile in Bezug auf Robustheit, schnelle Reaktion, Benutzerfreundlichkeit, Miniaturisierung, hohe Empfindlichkeit, niedrige Nachweisgrenzen, kleine Analytvolumina, die Fähigkeit, mit trüben Proben zu arbeiten und Markierungsfreiheit zu arbeiten, eingehend für verschiedene Anwendungen untersucht12, 14. Diese Eigenschaften müssen bei der Analyse von Umwelt- und Lebensmittelproben in einer Verarbeitungsanlage berücksichtigt werden, in der benutzerfreundliche Geräte und eine einfache Probenvorbereitung erforderlich sind15,16. Es ist bekannt, dass die Ablagerung von Metallnanopartikeln (wie Platin) und/oder Polymeren auf der Oberfläche elektrochemischer Sensoren die Oberfläche und/oder die elektrische Leitfähigkeit erheblich vergrößert und außerdem die Immobilisierung des Bioerkennungsmittels verbessert, was zu einer höheren Empfindlichkeit, einer schnelleren Erfassung und einer Verbesserung führt Nachweis der Zielbakterien17. Die Rolle von Platin-Nanopartikeln im Bereich der Biosensorik wurde kürzlich von Yu et al.18 untersucht, die ihre Eigenschaften zusammenfassen, darunter hohe Stromdichten, schnellen Massentransport und verbesserte elektrokatalytische Eigenschaften, die zu verbesserten Schlüsselleistungsindikatoren des Sensors führen19,20,21 ,22.

Aptamere sind einzelsträngige Oligonukleotide und zeigen bei richtiger Auswahl und Anwendung im richtigen Bindungspuffer eine hohe Affinität gegenüber Zielen23. Aptamere binden spezifisch über Wechselwirkungen zwischen Ziel(en) und exponierten Strukturen24,25. Aptamere haben zahlreiche Vorteile gegenüber Antikörpern, darunter niedrige Synthesekosten, hohe Reproduzierbarkeit, hohe thermische Stabilität und die Fähigkeit, verschiedene funktionelle Gruppen zu modifizieren und/oder zu integrieren (z. B. Biotinylierung, Thiolierung usw.)25,26. Umfassende Übersichten zu Aptamer-basierten Technologien für den Nachweis von Krankheitserregern in Lebensmitteln fassen die jüngsten Entwicklungen bei optischen und elektrochemischen Biosensoren (d. h. Aptasensoren)24,27,28 zusammen, einschließlich Plattformen, die an DNA-Aptameren konjugierte Magnetkügelchen und Antikörper-Aptamer-funktionalisierte faseroptische Sensoren verwenden Nachweis von L. monocytogenes-Zellen aus kontaminierten verzehrfertigen Fleischprodukten29. Hills et al.30 und Oliveira et al.31 berichteten über einen Sensormechanismus für den Nachweis von L. monocytogenes in Lebensmittelproben unter Verwendung der Betätigung verschiedener Chitosan-Aptamer-Nanobürsten unter Verwendung des von Ohk et al.29 entdeckten Aptamers. Kürzlich haben Sidhu et al.32 einen Aptasensor entwickelt, der ineinandergreifende Platin-Mikroelektroden verwendet, die mit demselben DNA-Aptamer für Listeria spp. funktionalisiert sind. Erkennung in Gemüsebrühe und hydroponischen Medien durch Einbau des Sensors in eine Partikel-/Sedimentfalle zur Analyse des Bewässerungswassers vor Ort.

Die Verwendung von auf Reize reagierenden Polymeren zur Betätigung in Sensoranwendungen hat in den letzten Jahren zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen, wie in einem aktuellen Aufsatz von Hu et al.33 zusammengefasst. Auf Reize reagierende Polymere unterliegen als Reaktion auf äußere Reize großen Veränderungen in Löslichkeit, Volumen und/oder Konformation und wurden verwendet, um die natürlich vorkommende Reaktion auf äußere Veränderungen in der Umgebung nachzuahmen, die in lebenden Systemen beobachtet wird33,34,35. Natriumalginat ist ein natürliches, ungiftiges, biologisch abbaubares und kostengünstiges Polysaccharid, das sich wiederholende Mannuron- und Guluronsäuren enthält. Alginat ist ein anionisches Molekül mit einem pKa von etwa 3,5. Oberhalb des pKa-Werts ist Alginat hydrophil und in Umgebungen unterhalb dieses pH-Werts ist es hydrophob36,37. Frühere Arbeiten nutzten Polymerbetätigung zur Verbesserung der Bakterieneinfang38 und kürzlich untersuchten Hills et al.30 und Giacobassi et al.39 die Betätigung von stimuliresponsiven Polymeren sowohl für die Einfangung als auch für die Erkennung von Krankheitserregern in komplexen Medien. Diese Studien haben erfolgreich gezeigt, dass durch die Steuerung der Polymeraktivierung im Mikromaßstab Krankheitserreger eingefangen werden können, wenn das Polymer gedehnt wird, und die Signalübertragung nach dem Kollabieren des Polymers an der Sensoroberfläche verbessert wird30,39. Allerdings wurden in diesen früheren Studien Metallnanopartikel und Polymere schichtweise abgeschieden, um die Sensoren herzustellen30,40, was einen mehrstufigen Herstellungsprozess erforderte. Eine der größten Herausforderungen in diesen früheren Arbeiten bestand darin, die Nanobürste an die Oberfläche zu binden, gefolgt von der Biofunktionalisierung, bei der unspezifische Vernetzungstechniken zum Einsatz kamen und die Kontrolle des Oberflächenbindungsgrads im Vergleich zur Biorezeptorimmobilisierung eine Herausforderung darstellte.

Hierbei konzentrieren wir uns auf die Entwicklung einer einstufigen Co-Elektroabscheidung von Alginat-Thiomeren und Nanoplatin als Aptasensor-Plattform. Wir bauen auf dieser einzigartigen Alginat-Thiomer-Plattform (ALG-Thiomer) auf, um einen schnellen, markierungsfreien Biosensor zum Nachweis von L. monocytogenes zu entwickeln. Frühere Studien haben die gleichzeitige galvanische Abscheidung von Alginat und anderen leitfähigen Materialien wie Graphit und MnO2-C41,42 gezeigt, aber nach unserem besten Wissen ist unsere Arbeit die erste, die die gleichzeitige galvanische Abscheidung von ALG-Thiomeren und Platin für die Biosensorik zeigt eröffnet ein neues und spannendes Forschungsgebiet für die Entwicklung von Nano-Biosensoren. Wir haben die ALG-Thiomer-Abscheidungsbedingungen unter verschiedenen Kombinationen von Spannung, ALG-Thiomer-Konzentration und Sonoelektroabscheidungszyklen optimiert und so eine bis zu siebenfache Vergrößerung der elektroaktiven Oberfläche für die besten Bedingungen erreicht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das höchste Signal-Rausch-Verhältnis erreicht wurde, wenn die Zellerfassung in der erweiterten Bürstenkonformation und die Erfassung in der kollabierten Bürstenkonformation erfolgte. Schließlich zeigen wir, dass der ALG-Thiomer/Pt-Nanobürsten-Biosensor L. monocytogenes in einer Lebensmittelmatrix in Konzentrationen von nur 5 KBE mL-1 und in Gegenwart anderer grampositiver Zellen in weniger als 17 Minuten selektiv nachweisen kann, ohne dass dies erforderlich ist Probenvorkonzentration oder Redoxmarkierungstechniken.

Natriumphosphat dibasisch, Kaliumphosphat monobasisch, Hydrochinon (C6H4(OH)2, Chloroplatinsäure (8 % w/w) und Hexaaminruthenium(III)chlorid (Ru(NH3)6Cl3) wurden von Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO). Aluminiumoxidaufschlämmung (0,05 µm) und polykristalline Diamant-Mikrosuspensionen (3 µm und 1 µm) wurden von Buehler (Lake Bluff, IL) gekauft. Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl)-Referenz, Platin/Iridium-Arbeit (Pt /Ir, 1,6 mm Durchmesser) und Platin-Hilfselektroden wurden von BASinc (West Lafayette, IN) erworben. Bleiacetat (30 % w/v) wurde von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) bezogen. 1-Ethyl-3- (3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid HCl (EDC) und Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC) wurden von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) erworben. Kaliumferrocyanidtrihydrat (K4Fe(CN)6 ·3H2O) wurde von Ward's Science (Rochester, NY) erworben. Cysteinhydrochlorid-Monohydrat und Kaliumferricyanid (K3Fe(CN)6) wurden von JT Baker (Phillipsburg, NJ) erworben. Alginsäure-Natriumsalz (niedrige Viskosität), N-Hydroxysuccinimid (NHS), Platindraht (99,95 % Pt, 1,5 mm Durchmesser), 5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (Ellman-Reagenz) und 2- (Morpholino)ethansulfonsäure (MES)-Puffer wurden von Alfa Aesar (Ward Hill, MA) erhalten. Von Ohk et al.29 erstellte Aptamere, die auf das L. monocytogenes-Membranprotein Internalin A (KD = 103 KBE/ml, 47 DNA-Basen und 15.008 g/mol) abzielen, wurden von Gene Link Inc. (Hawthorne, NY) erhalten. Hefeextrakt, tryptische Sojabrühe (TSB), gepuffertes Peptonwasser (BPW) und tryptisches Sojaagar (TSA) wurden von Becton, Dickson and Company (Sparks, MD) bezogen. Lagerstabile Gemüsebrühe (UHT, ultrahocherhitzt verarbeitet) wurde in einem örtlichen Lebensmittelgeschäft erworben. Dialyseschläuche (DiaEasy™, 3,5 kDa MWCO) wurden von Biovision (Milpitas, CA) bezogen. Kaliumchlorid (KCl) und Natriumchlorid (NaCl) wurden von EMD Millipore Corporation (Burlington, MA) bezogen. Kaliumnitrat (KNO3) wurde von British Drug Houses (ON, Kanada) erworben. Trisethylendiamintetraessigsäure (TE)-Puffer (pH 7,4) wurde von Quality Biological (Gaithersburg, MD) bezogen. Tryptosephosphatbrühe (TPB) wurde von HiMedia (Mumbai, Indien) bezogen.

Bakterienkulturen, Listeria monocytogenes (ATCC 15313) und Staphylococcus aureus (ATCC 25923), wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA) erworben und als Ziel- und Interferenzbakterien für Empfindlichkeits- bzw. Selektivitätstests verwendet. Für die Durchführung von Experimenten mit den pathogenen Mikroorganismen S. aureus und L. monocytogenes wurden die vom National Institute of Health festgelegten Standards der Biosicherheitsstufe 2 verwendet. Alle ursprünglich bei –80 °C gelagerten Bakterienkulturen wurden durch identische und aufeinanderfolgende Doppelübertragungen auf Wachstumsmedien, TPB für L. monocytogenes und TSB für S. aureus, übertragen und unter aeroben Bedingungen 24 Stunden lang bei 35 °C inkubiert. CS aureus und L. aureus monocytogenes-Kulturen wurden bis zu 3 Monate lang bei 4 °C auf tryptischem Soja-Agar (TSA) bzw. TSA mit 0,6 % (w/v) Hefeextrakt (TSAYE) schräg gehalten. Schrägtransfers auf Wachstumsmedien wurden durchgeführt, um Bakterienkulturen für die Analyse vorzubereiten. Bakterienproben wurden gezählt, indem die Proben zunächst seriell in BPW verdünnt und auf TSA und TSAYE für S. aureus bzw. L. monocytogenes ausplattiert wurden; nach 48 h bei 35 °C; Die Ergebnisse wurden als CFU ml−1 aufgezeichnet.

Natriumalginat wurde modifiziert, um eine Thiolgruppenterminierung durch Bildung einer Amidbindung zwischen Carbonsäuregruppen von Natriumalginat und primären Aminogruppen von Cystein unter Verwendung einer Carbodiimid-vermittelten Kopplung wie bei Jindal et al.43 einzubauen. Bei dieser Methode werden die Carboxylgruppen des Alginats mit EDC bei pH 6 für 45 Minuten aktiviert. Dann wurde Cysteinhydrochlorid-Monohydrat in einem Gewichtsverhältnis von 2:1 (Alginat:Cystein) zugegeben und 2 Stunden lang bei pH 4 reagieren gelassen, gefolgt von einer weiteren Stunde bei pH 6 (Herstellungsschritte siehe Abb. 1). Die Reaktion wurde unter kontinuierlichem Rühren bei Raumtemperatur durchgeführt.

Schematische Darstellung der Schritte zur Herstellung, Biofunktionalisierung und Erkennung der ALG-Thiomer/Pt-Bürsten, funktionalisiert mit einem für L. monocytogenes selektiven Aptamer. Zunächst werden ALG-Thiomere auf der Grundlage der Reaktion von Natriumalginat mit Cystein unter Verwendung der N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimid (EDC)-Chemie gebildet. Anschließend werden ALG-Thiomer und Platin gleichzeitig sonoelektrolytisch auf der Arbeitselektrode abgeschieden, was zu ALG-Thiomer/Pt-Bürsten führt, die mittels REM-Bildgebung dargestellt werden. Als nächstes wurden die ALG-Thiomer/Pt-Bürsten mittels Carbodiimid-Vernetzungschemie mit Aptamer funktionalisiert. Die Erfassungsstrategie bestand aus der Aktivierung der ALG-Thiomer/Pt-Bürsten vom kollabierten in den ausgefahrenen Zustand auf der Grundlage von pH-Änderungen: Die Bakterienerfassung erfolgte bei pH 7 mit Bürsten im ausgefahrenen Zustand, gefolgt von der Messung (Erfassung), wenn die Bürsten bei pH 3 kollabiert waren.

Anschließend wurde die Lösung dialysiert (Molekulargewichtsgrenze 3,5 kDa), um das Alginat-Cystein-Konjugat (ALG-Thiomer) zu isolieren. Die Dialyse umfasste zwei Tage gegen 1 mM HCl (pH 4), gefolgt von einem Tag in 1 mM HCl und 1 % (w/v) NaCl und weiteren zwei Tagen in 1 mM HCl (alle Lösungen wurden zweimal täglich ausgetauscht). . Anschließend wurde die Suspension in einer Labconco FreeZone 6-Einheit (Labconco, Kansas City, MO, USA) gefriergetrocknet (– 50 ° C, – 0, 120 mBar, 48 h). Anschließend wurden die ALG-Thiomere bis zur Verwendung zur Sensormodifikation unter Stickstoffatmosphäre bei 5 °C gelagert.

Der am Alginat erreichte Modifikationsgrad wurde durch Quantifizierung der Menge an Thiolgruppen durch Ellman-Analyse gemäß den Anweisungen von Thermo Fisher Scientific44 bestimmt. Kurz gesagt, die Proben und 5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure), nämlich Ellmans Reagenz, wurden in Phosphatpuffer mit EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) bei pH 8 gemischt und ihre Absorption wurde bei 412 nm gegen eine Blindkontrolle gemessen unter Verwendung eines Spektrophotometers (Genesys 10S, Thermo Scientific, Waltham, MA). Zur Quantifizierung der Thiolkonzentration (ausgedrückt als μmol Thiolgruppen g−1) wurde eine Standardkurve mit Cysteinhydrochlorid-Monohydrat erstellt.

Alginat und Platin wurden mithilfe der von Taguchi et al.19 entwickelten Sonoelektroabscheidungsmethode gleichzeitig auf der Oberfläche von Platin/Iridium-Arbeitselektroden (die zuvor gemäß den Anweisungen des Herstellers poliert wurden) abgeschieden (Abb. 1). Bei dieser Methode wurde über eine Stromversorgung ein Platindraht (Anode) und die Arbeitselektrode (Kathode) verbunden und 1 s lang ein festes Potential angelegt, gefolgt von 1 s Beschallung der Abscheidungslösung in abwechselnden Zyklen. Die Abscheidungslösung enthielt 0,72 % (Gew./Vol.) Chlorplatinsäure, 0,001 % (Gew./Vol.) Bleiacetat und ALG-Thiomer in unterschiedlichen Konzentrationen (0,05, 0,075 und 0,1 % G/V). Spannungen von 1,5, 5,75 und 10 V für 60, 100 und 140 Sonoelektroabscheidungszyklen wurden ebenfalls ausgewertet, um die optimalen Abscheidungsbedingungen zu bestimmen.

Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wurde verwendet, um die Morphologie der besten Bürstenablagerungsbedingungen basierend auf den elektrochemischen Experimenten zu analysieren. Nach der Beschichtung der mit ALG-Thiomer/Pt-Bürsten modifizierten Elektrode mit einer 5 nm dicken Platinschicht [Cressington Sputter Coater 208 HR (Watford, Vereinigtes Königreich)] wurden REM-Bilder mit einem FEI Quanta 600 FEG (Hillsboro, OR) aufgenommen ). Für die Oberflächenabbildung wurden 10.000- und 16.000-fache Vergrößerungen mit einer Beschleunigungsspannung von 10 kV verwendet.

Die Oberflächenchemie der mit der ausgewählten optimierten Bürstenabscheidung beschichteten Elektroden wurde durch Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) analysiert, durchgeführt in einem Omicron ESCA + (Scienta Omicron, Schweden) mit CN10-Elektronenkanone und Mg/Al-Doppelröntgenkanone .

Jeder Schritt der Biosensor-Vorbereitung (Alginat-Platin-Abscheidung, Aptamer-Beladung und Bakterienerkennung) wurde elektrochemisch unter Verwendung eines 3-Elektroden-Zellsystems (Arbeits-, Ag/AgCl-Referenz- und Platin-Hilfselektroden) bei Raumtemperatur unter Verwendung von zyklischer Voltammetrie (CV) charakterisiert /oder elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS)-Methoden, beschrieben von Burrs et al.17 unter Verwendung eines CHI 600E Potentiostat/Impedanzanalysators. Der CV-Test wurde in einer 4 mM Fe(CN)63− in 1 mM KNO3-Lösung mit Scanraten von 50, 100, 150 und 200 mV/s, 650 mV Schaltpotential und 10 s Ruhezeit durchgeführt. CV wurde verwendet, um die elektroaktive Oberfläche (ESA in cm2) der Elektroden mithilfe der Randles-Sevcik-Theorie zu ermitteln, wobei die Steigung des Stroms gegenüber der Quadratwurzel der Scanrate (ip gegenüber v1/2) verwendet wurde, wie zuvor berichtet19,45 (siehe Weitere Informationen finden Sie in den unterstützenden Informationen). Die ESA-Werte wurden verwendet, um die besten Abscheidungsparameter (ALG-Thiomer-Konzentration, Spannung und Anzahl der Sonoelektroabscheidungszyklen, wie in ALG-Thiomer/Platin-Nanobürstenabscheidung beschrieben) zu bestimmen, sowie um die Bürstenbetätigung zu charakterisieren und die Aptamer-Beladungskonzentration zu bestimmen (Einzelheiten siehe Hintergrundinformationen).

Für die Betätigungstests wurden eine negativ geladene Sonde (KFeCN63−), eine neutrale Sonde (C6H4(OH)2) und eine positiv geladene Sonde Ru(NH3)63+ verwendet. Der pH-Wert der Redox-Sondenlösung wurde mit einer 1 M HCl- oder NaOH-Lösung auf pH 7 oder pH 3 eingestellt. Der pH-Wert der Redoxlösung wurde während der CV-Tests überwacht, um sicherzustellen, dass sich der gemeldete pH-Wert nicht um mehr als 0,5 pH-Einheiten änderte. Betätigungstests wurden auch in Gegenwart einer konstanten Listerien-Hintergrundkonzentration von 103 KBE ml-1 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter Verwendung von EIS durchgeführt, um die effizienteste Einfang- und Messstrategie zwischen ausgedehnter und kollabierter Konformation der Bürsten zu bestimmen.

EIS wurde verwendet, um die Nachweisgrenze (LOD), den Nachweisbereich und die Empfindlichkeit des Biosensors zu bestimmen, wenn er Bakterien in Konzentrationen zwischen 101 und 106 KBE ml-1 (Standardkurve) ausgesetzt wurde. Einzelheiten zum Funktionalisierungsverfahren von ALG-Thiomer/Pt-Bürsten mit Aptameren finden Sie in den Hintergrundinformationen. Die Analyse wurde mit einem anfänglichen Gleichstrompotential von 0 V, einer Wechselstromamplitude von 100 mV und einem Frequenzbereich von 1–100.000 Hz durchgeführt. Der Empfindlichkeitstest wurde zunächst in PBS und dann erneut in handelsüblicher steriler Gemüsebrühe durchgeführt. Aus den Bode-Diagrammen (Impedanz vs. Frequenz) wurde der Impedanzwert bei fester Grenzfrequenz zur Erstellung der Kalibrierungskurven verwendet, bestehend aus der Impedanz (Ohm) vs. der Zellkonzentration (log CFU mL−1). Aus den Kalibrierungskurven (R2 > 0,97) wurde die Empfindlichkeit gegenüber dem Zielbakterium mithilfe der Steigung des linearen Teils ermittelt und anschließend die 3σ-Methode zur Berechnung der Nachweisgrenze (LOD)39 verwendet. Die Änderung der Impedanz (\(\mathrm{\Delta Z}= {Z}_{Bakterien}-{Z}_{keine \, Bakterien}\)) wurde verwendet, um die Leistung der Elektroden unabhängig vom Medium zu veranschaulichen. Die Selektivität für L. monocytogenes wurde durch Bestimmung der Empfindlichkeit und LOD in Gegenwart der identischen Konzentration eines anderen grampositiven Bakteriums (S. aureus) in PBS und in steriler Gemüsebrühe bewertet.

Die Ergebnisse unabhängiger Experimente wurden mindestens dreifach durchgeführt und als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Zur Durchführung der statistischen Analyse wurde die Software SPSS verwendet. ANOVA (einfache Varianzanalyse) wurde zum Testen der Signifikanz verwendet und auf dem Niveau p < 0,05 ausgedrückt. Durch den Tukey-Test wurden deutlich unterschiedliche Mittelwerte getrennt.

Die Effizienz der ALG-Thiomer-Reaktion wurde zunächst durch Ellmans Analyse bewertet. Das erhaltene Ergebnis betrug 1050 ± 200 μmol Thiolgruppen g−1 des Polymers, etwa dreimal höher als der von Jindal et al.43 mit einem ähnlichen Verfahren angegebene Thiolgehalt von 324,54 μmol g−1. In unserem Ansatz reagiert EDC (eine Carbodiimidverbindung) mit Carbonsäuregruppen des Alginats und bildet ein aktives O-Acylisoharnstoff-Zwischenprodukt, das durch die primären Aminogruppen des Cysteins ersetzt wird und eine Amidbindung mit der ursprünglichen Carboxylgruppe bildet (siehe Abb . 1). N-Hydroxysuccinimid (NHS) kann in die Reaktion einbezogen werden, um die Effizienz zu verbessern, da das EDC NHS an Carboxyle koppelt und einen NHS-Ester bildet, der erheblich stabiler ist als das O-Acylisoharnstoff-Zwischenprodukt46. Marcano und Sabino47 berichteten über einen höheren Wert von 1939 μmol g−1 Thiolgruppen durch Einbeziehung von NHS in die Aktivierungsreaktion mit EDC. Dieser Ansatz führt jedoch zusätzliche funktionelle Gruppen ein, die sich vernetzen können, was die Fähigkeit zur Steuerung der Bürstenbetätigung verringert und zu experimentellen Fehlern führt.

Das Vorhandensein der Thiolgruppe in der Ellman-Analyse weist darauf hin, dass Schwefel in der Probe vorhanden ist, liefert jedoch keine Informationen über den Zustand des Schwefels (reaktive Sulfhydrylgruppe oder oxidiert), da die Thiolgruppe bei Einwirkung von Luftsauerstoff sehr anfällig für Oxidation ist mit möglicher Bildung einer disulfidähnlichen Bindung oder Vernetzung (–S–S–)47.

Eine XPS-Analyse wurde durchgeführt, um die chemischen Bindungen für die besten Abscheidungsbedingungen im Zusammenhang mit der elektrochemischen Reaktion zu charakterisieren (siehe Hintergrundinformationen für detaillierte Ergebnisse und Diskussion). Das XPS-Spektrum der ALG-Thiomer/Pt-Bürstenabscheidung (Abb. 2a) zeigt die effektive Abscheidung sowohl von ALG-Thiomer- als auch von Pt-Komponenten mit charakteristischen Peaks von C 1s, O 1s, N 1s und S 2p von ALG-Thiomer und Pt 4f aus Platin. Der N 1s-Peak bei 399 eV liegt im Bereich für Cystein-Metallkomplexe48. Die Bindungsenergie von 400 eV kann mit der Anwesenheit einer Amingruppe40 oder mit dem Cystein49 in Verbindung gebracht werden. In ähnlicher Weise präsentierten Wang et al.50 und Li et al.51 kleine S 2p- und N 1s-Peaks im gleichen Bereich wie in der vorliegenden Arbeit, was durch den Vergleich ihrer XPS auf das Vorhandensein dieser Komponenten auf Kohlenstoffpunkten (Trinatriumcitrat-Cystein-Komplexen) hinweist Vollspektrum mit reinem Cystein) bzw. selbstorganisierte Alkanthiol-Monoschicht auf metallischem Pt. Die S 2p-Bindungsenergie von 164 eV (Abb. 2b) ist charakteristisch für Thiol52 bzw. seine Koordination an die Metallionen48. Der Peak bei 162,5 eV (S 2p) liegt ebenfalls im erwarteten Bereich für Metall-Schwefel-Bindungen52. Yang und Agrios53 führten ein Dublett in der S 2p-Region einer Pt-modifizierten 4-Mercaptobenzoesäure bei etwas niedrigeren Werten (161,84 eV und 163,04 eV) als den in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Werten (162,5 eV und 164 eV) mit der Bildung eines Pt in Verbindung –S-Bindung. Castner et al.54 berichteten auch über die Bindungsenergie von 161,9 eV, was mit den Schwefelatomen übereinstimmt, die als Thiolatspezies an die Goldoberfläche gebunden sind. Der S 2p-Peak in der Nähe von 168,5 eV könnte auf die Anwesenheit von oxidiertem Schwefel zurückzuführen sein48,53. Das Pt-4f-Spektrum (Abb. 2c) zeigt zwei Peaks bei 71 eV und 74,3 eV, die S-gebundenem Pt entsprechen, was mit Literaturberichten für Pt in Kontakt mit S-Atomen 53,55 übereinstimmt. Romanchenko et al.56 ordneten Pt0-Metallnanopartikeln eine Bindungsenergie von 71,5 eV und Pt(IV)-S-Verbindungen eine Bindungsenergie von 74 eV zu, was auch in der vorliegenden Studie der Fall sein könnte, da: (1) Pt sich direkt auf dem Nanopartikel ablagern könnte Elektrodenoberfläche sowie Bindung an ALG-Thiomer vor der Abscheidung, und (2) die Elektroabscheidung unter Verwendung von Chlorplatinsäure beinhaltet Pt(IV)-Kationen und deren Reduktion zu Pt057. Insgesamt deuten die in Abb. 2 gezeigten XPS-Spektren auf eine Bindung zwischen den Pt-Nanopartikeln und den S-Atomen im ALG-Thiomer hin.

Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS)-Analyse. (a) Übersichtsspektrum, (b) S 2p-Spektrum und (c) Pt 4f-Spektrum, die die erfolgreiche gemeinsame Abscheidung von ALG-Thiomer und Pt auf Elektroden zeigen. Durchgezogene Linien mit glatten Kurven stammen von der XPS Peak-Software, die zur Identifizierung der S 2p- und Pt 4f-Peaks verwendet wird.

Die Morphologie der Nanoplatin- und Alginatbürsten für die besten Ablagerungsbedingungen im Zusammenhang mit der elektrochemischen Reaktion (siehe Details in den unterstützenden Informationsergebnissen und der Diskussion) ist in Abb. 3 dargestellt. Die ALG-Thiomer/Pt-Bürstenabscheidung bildete nebeneinander liegende Sphäroide (Bürstenendknoten). mit Durchmessern zwischen 80 und 400 nm und einer gleichmäßigen Beschichtung mit einigen zufälligen blumenkohlförmigen Strukturen, die über die gesamte Oberfläche verteilt sind. Eine ähnliche, wenn auch glattere Struktur wurde von Chen et al.42 bei der gleichzeitigen galvanischen Abscheidung von Alginat und MnO2-C-Komposit präsentiert. Eine ähnliche Sphäroidstruktur, wenn auch poröser und dreidimensionaler, wurde von Giacobassi et al.39 mit der Abscheidung von PNIPAAm-Bürsten über reduzierten Graphenoxid- und Platinschichten gezeigt. Ähnlich wie bei den von Giacobassi et al.39 beschriebenen PNIPAAm-Bürsten führte die galvanische Abscheidung von ALG-Thiomer/Pt-Bürsten zu einer homogenen Bürstenbildung mit gleichmäßiger Verteilung der Schaft- und Knotengrößen. Laut Taguchi et al.19 fördert das gepulste Sonoelektroabscheidungsverfahren einen erhöhten Stofftransfer zur Elektrodenoberfläche, was zu einer gleichmäßigen Materialabscheidung führt. Die in der vorliegenden Arbeit erhaltenen relativ großen und glatten Strukturen sind zu erwarten, da der gleichzeitig abgeschiedene ALG-Thiomer-Komplex ein signifikant großes Polymermaterial ist, was auch von Giacobassi et al.39 beobachtet wurde. Die Form der Sphäroide vergrößert die Oberfläche, was zu einer deutlichen Vergrößerung der elektrochemischen Oberfläche im Vergleich zur bloßen Elektrode führt (siehe Ergebnisse und Diskussion in den Hintergrundinformationen). Darüber hinaus wird erwartet, dass die Bürstenkonfiguration in Kombination mit der Bürstenbetätigung zu einer erhöhten Exposition der Aptamere gegenüber dem Medium und einer anschließenden Bakterienbindung führt, wie zuvor von Giacobassi et al.39 und Hills et al.30 berichtet (siehe Ergebnisse, Abschnitte „ALG- Thiomer/Pt-Bürstenbetätigung und Listeria spp.-Einfang“ und „Biosensor-Leistungstests“). Unter Berücksichtigung der Bedeutung der Morphologie für die Erfassungsleistung sollten weitere Untersuchungen zu den Auswirkungen der verschiedenen Ablagerungsparameter auf die Morphologie durchgeführt werden.

Rasterelektronenmikroskopische Bilder von ALG-Thiomer/Pt-Bürsten bei 10 kV und (a) 10.000- bzw. (b) 16.100-facher Vergrößerung zeigen eine gleichmäßige Bürstenbildung und -ablagerung über der Elektrodenoberfläche mit Endknoten im Bereich zwischen 80 und 400 nm im Durchmesser.

Alginat ist ein saures Polymer mit einem pKa-Wert zwischen 3,2 und 4 (für Guluronsäure bzw. Mannuronsäure)37,58. Normalerweise werden Carbonsäuregruppen unterhalb des pKa-Werts des Alginats in der COOH-Form protonisiert und das Polymer zerfällt. Wenn der pH-Wert der Lösung steigt, wird das COOH zu COO− ionisiert und die daraus resultierende elektrostatische Abstoßung zwischen diesen Gruppen führt dazu, dass sich das Polymer ausdehnt37,59,60. Um zu testen, ob die pH-Stimuli-Betätigungseigenschaft von Alginat durch seine Modifikation beeinflusst wurde, und um die elektrostatischen Wechselwirkungen während der Betätigung an der Elektrodenoberfläche zu charakterisieren, wurden CV-Tests mit drei verschiedenen Redoxsonden durchgeführt und die ESA-Werte berechnet (Abb. 4a). . Es wurden eine negativ geladene Sonde (KFeCN63−), eine neutrale Sonde (C6H4(OH)2) und eine positiv geladene Sonde Ru(NH3)63+ verwendet. Darüber hinaus wurde CV bei einem pH-Wert von 3 und 7, jeweils unter bzw. über dem pKa-Wert des Polymers (Abb. 4a), für drei sich wiederholende Zyklen durchgeführt.

(a) Elektrostatische Wechselwirkungen während drei Betätigungszyklen zwischen pH 3 und pH 7 der ALG-Thiomer/Pt-Bürsten mit verschiedenen Redoxsonden: einer positiv geladenen Sonde (Ru(NH3)63+, einer negativ geladenen Sonde (KFeCN63−) und eine neutrale Sonde (C6H4(OH)2). (b) Durchschnittliche Gesamtimpedanz für die ALG-Thiomer/Pt-Bürste, funktionalisiert mit 400 nM Aptamer und exponiert mit 103 KBE ml−1 Listeria monocytogenes bei verschiedenen Grenzfrequenzen für verschiedene Erfassungen/Messungen Strategien basierend auf der Betätigung. „EX“ bezieht sich auf den erweiterten Zustand (pH 7), „COL“ bezieht sich auf den kollabierten Bürstenzustand (pH 3), „cap“ bezieht sich auf die Zellerfassung und „meas“ bezieht sich auf die Messung. Fehlerbalken bezeichnen die Standardabweichung des arithmetischen Mittels von mindestens drei Wiederholungen; unterschiedliche Buchstaben stehen für deutlich unterschiedliche Mittelwerte (p < 0,05).

Wie in Abb. 4a gezeigt, nimmt oberhalb des pKa-Werts (pH 7) der Elektronentransport mit der KFeCN63−-Sonde aufgrund von Ladungsabstoßung/sterischer Hinderung ab, da die Alginatcarboxylatgruppe negativ geladen ist; mit der neutralen Sonde (C6H4(OH)2) wird der Elektronentransfer weniger beeinflusst, es kann jedoch aufgrund der intramolekularen elektrostatischen Abstoßung zwischen den Carboxylatgruppen (COO−) des Alginats dennoch zu einer gewissen Schwellung kommen59; und mit der Ru(NH3)63+-Sonde steigen Spitzenstrom und ESA aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen. Unterhalb des pKa-Werts (pH 3) ist das Gegenteil der Fall: Der Elektronentransfer wird begünstigt, wenn die negative Sonde den Spitzenstrom und die ESA erhöht, während der Spitzenstrom und die ESA mit der positiven Sonde sinken. Ein ähnliches Verhalten der Erhöhung oder Verringerung der ESA aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen bzw. Abstoßung wurde auch von Oliveira et al.31 und Hills et al.30 für die Chitosan-Aktivierung mit denselben Redoxsonden beobachtet. Bei wiederholter Betätigung änderten sich Spitzenstrom und ESA zwischen den Wiederholungen geringfügig (Abb. 4a). Die prozentuale Änderung war jedoch nicht signifikant und es war keine Hysterese zu beobachten, was darauf hindeutet, dass die ALG-Thiomer/Pt-Bürstenbetätigung reversibel ist und vom kollabierten in den ausgedehnten Zustand mehrmals (mindestens dreimal) wiederholt werden kann. Diese Ergebnisse stellen eine Verbesserung gegenüber Hills et al.30 und Giacobassi et al.39 mit der Bürstenbetätigung von Chitosan bzw. PNIPAAm dar, die über eine Betätigungshysterese zwischen den Wiederholungen berichteten.

Die ALG-Thiomer/Pt-Bürste wurde durch Funktionalisierung mit 400 nM Amino-terminiertem Aptamer über Carbodiimid-Vernetzung in einen Aptasensor umgewandelt, wie in Abb. 1 dargestellt (Einzelheiten siehe Hintergrundinformationen). Basierend auf dem Prinzip, dass die Bindung von Zielbakterien an das Aptamer den Elektronentransfer an der Elektrodenoberfläche verringert, was als Anstieg der Impedanz gemessen wird, wurden Aktivierungstests mit EIS durchgeführt, um die optimalen pH-Werte für die Erfassung und Erkennung von L. monocytogenes zu bestimmen . Für diese Experimente wurde eine konstante L. monocytogenes-Konzentration von 103 KBE ml−1 in PBS verwendet. In Abb. 4b ist die erweiterte Bürstenkonformation bei pH > 3,5 mit (EX) gekennzeichnet, die kollabierte Bürstenkonformation bei pH < 3,5 mit (COL), der Zelleinfangzustand mit (cap) und der elektrochemische Messschritt wird mit (meas) notiert. Das Einfangen von Zellen in der erweiterten Konformation (pH 7) und die Erfassung im kollabierten Zustand (pH 3) lieferten die höchsten Impedanzwerte (p < 0,05) für alle Grenzfrequenzen und damit die Erfassungseffizienz (siehe auch Bode-Diagramme in Abb. S3 im). zusätzliche Informationen). Das optimale Einfangen gezielter Bakterien in der erweiterten Form kann mit einer größeren Kontaktfläche mit der getesteten Lösung und einer erhöhten Wahrscheinlichkeit einer Aptamer-Zell-Wechselwirkung im Vergleich zu pH 3, bei dem die Bürsten kontrahiert werden, und der Rezeptorbindungsstelle(n) zusammenhängen ) ist möglicherweise nicht zugänglich. Ähnlich wie bei unserer vorherigen Arbeit zu dieser Einfangstrategie ist es wahrscheinlich, dass sich die Zellen während des Erfassungsschritts in der Polymermatrix verfangen, wobei die Bindung von Aptamer und Ziel möglicherweise nicht mehr der Mechanismus für das Einfangen von Zellen ist, sondern vielmehr eine Verschränkung während des Zusammenbruchs der Nanobürste. Die Spezifität dieser Detektionsplattform beruht auf der anfänglichen Affinität zwischen Aptamer und Ziel bei pH 7 (erweiterte ALG-Thiomer-Nanobürste), wobei der Zusammenbruch bei pH 3 wahrscheinlich zu Veränderungen der Sekundärstruktur im Aptamer führt, aber auch Zellen in der Polymermatrix einschließt.

Dieser Befund zur Einfangstrategie steht im Einklang mit den Ergebnissen von Hills et al.30 und Giacobassi et al.39, die ebenfalls eine höhere Erfassungseffizienz unter Verwendung der EX/cap → COL/meas-Strategie für die Pathogenerkennung zeigten. Darüber hinaus scheint die Modifizierung des Alginats mit Cystein und die anschließende Anbindung des Aptamers mithilfe seiner Carbonylgruppen die negativen Ladungen des Alginats zu neutralisieren, die normalerweise eine elektrostatische Abstoßung der (unter den meisten Bedingungen) stark negativ geladenen Membran von L. monocytogenes verursachen würden61. Diese Methode zum Einfangen von Bakterien ist im Vergleich zu anderen in der Literatur beschriebenen Methoden recht einfach, wie beispielsweise der Methode von Malic et al.62, die ein auf immunomagnetische Nanopartikel zugeschnittenes magnetisches Trenngerät mit hohem Gradienten entwickelt hat, das auf einer 3D-Magnetfalle basiert, die in ein polymeres Mikrofluidikgerät integriert ist magnetisches Einfangen und Freisetzen von L. monocytogenes.

Die dielektrischen Eigenschaften biologischer Gewebe werden durch drei Dispersionen charakterisiert, darunter: (a) α-Dispersion, die bei niedriger Frequenz auftritt und mit Gewebeschnittstellen wie Membranen verbunden ist; (b) β-Dispersion bei Hochfrequenz, verursacht durch die Polarisation von Zellmembranen, Proteinen und anderen organischen Makromolekülen; und (c) γ-Dispersion bei Mikrowellenfrequenz, verbunden mit der Polarisation von Wassermolekülen. Zellmembranen fungieren bei niedrigen Frequenzen als isolierende Barrieren und weisen Widerstandspfade auf, während sie bei höheren Frequenzen eine hohe Kapazität aufweisen. Folglich wurden die EIS-Betätigungsdaten zur Bestimmung der Grenzfrequenz (CF) verwendet. Diese Analyse wurde in einem Frequenzbereich von 1 bis 50 Hz durchgeführt, der dem Alpha-Frequenzdispersionsbereich biologischer Gewebe entspricht. Das maximale Impedanzsignal (p <0,05) wurde bei CF von 1 Hz beobachtet (Abb. 4b) und wurde ausgewählt, um im nächsten Abschnitt die wichtigsten Leistungsindikatoren (KPI) für den Aptasensor in komplexen Medien und Bakterienmischungen zu bestimmen.

Die Fähigkeit der Elektroden, die mit ALG-Thiomer/Pt-Bürsten, funktionalisiert mit 400 nM Amino-terminiertem Aptamer, aufgebracht waren, L. monocytogenes zu erkennen, wurde durch EIS bewertet. Einzelheiten zur Biosensor-Funktionalisierung und Ergebnisse zur optimalen Aptamer-Beladungskonzentration auf ALG-Thiomer/Pt-Bürsten finden Sie in den Hintergrundinformationen (Abb. S2). Im Bereich der Biosensoren eignet sich EIS besonders gut zum Nachweis von Bindungsereignissen auf der Wandleroberfläche, ohne dass Markierungen (wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzyme, Redox- oder radioaktive Verbindungen) erforderlich sind63. Der impedimetrische Begriff entsteht, weil die Schnittstelle (bei Besetzung der rezeptiven Zentren) ein elektrisches Hindernis für die Übertragung von Ladungen bietet, das als Funktion der Zielbindung an die Schnittstelle zunimmt, was die markierungsfreie Biosensorik ermöglicht64. Durch das Vorhandensein von Bakterien verursachte Impedanzunterschiede (im Bereich von 100 bis 103 KBE mL−1) wurden mit der EX/Cap → COL/meas-Strategie (pH 7 → 3) ermittelt. Die gesamte Testzeit betrug 17 Minuten, davon 15 Minuten für die Bakterienerfassung und 2 Minuten für die EIS-Messung. Bode-Diagramme werden über einen Frequenzbereich von 1 Hz bis 100 kHz angezeigt; Die Einschübe sind in der Ansicht des unteren Frequenzbereichs (1–5 Hz) vergrößert dargestellt. Basierend auf der in Abb. 4b dargestellten Grenzfrequenzanalyse (CF) wurden alle Kalibrierungskurven unter Verwendung von Daten aus Bode-Diagrammen für eine CF von 1 Hz entwickelt.

Abbildung 5 zeigt eine ALG-Thiomer/Pt/Aptamer-Nanohybrid-Elektrode, kalibriert für L. monocytogenes (y = 39,21x + 631,64, R2 = 0,99) und in Gegenwart von S. aureus (y = 69,34x + 719,16, R2 = 0,98). Der Selektivitätstest wurde mit Staphylococcus aureus durchgeführt, da dieser Listeria als grampositives Bakterium ähnelt und beide bekannte lebensmittelbedingte Krankheitserreger sind und außerdem ähnliche Größen (0,5–2 µm) aufweisen. Die Zugabe einer gleichen Konzentration von S. aureus zur Testlösung zeigte keine signifikante Beeinträchtigung (p > 0,05) der LOD (4,5 ± 0,8 KBE ml–1 mit L. monocytogenes allein und 5,7 ± 2,1 KBE ml–1 mit beiden Bakterien), was darauf hindeutet, dass es keine Kreuzreaktion zwischen dem Sensor und S. aureus gibt. Die Empfindlichkeit stieg (p < 0,05) von 39,21 ± 2,61 Ω/log(KBE ml−1) mit L. monocytogenes allein auf 69,34 ± 2,79 Ω/log (KBE ml−1), wenn auch S. aureus vorhanden war. Der lineare Bereich änderte sich auch von 101–106 KBE ml–1 mit nur L. monocytogenes in PBS auf 101–105 KBE ml–1 in der Bakterienmischung. Ohk et al.29 präsentierten einen LOD von 103 KBE mL−1 unter Verwendung des gleichen Aptamers in einem faseroptischen Biosensor zum Nachweis von Listeria spp. Kürzlich präsentierten Oliveira et al.31 unter Verwendung desselben Aptamers ähnliche LODs im Vergleich zur aktuellen Studie für L. monocytogenes allein in PBS und in Gegenwart von S. aureus, 2,5 bzw. 2,6 KBE ml–1; durch Betätigung von Chitosan/Platin-Bürsten. Während Antikörpersensoren Berichten zufolge dazu neigen, falsch positive Reaktionen mit S. aureus auszulösen, das ebenfalls ein Protein-A-Träger ist, erwies sich das in der vorliegenden Arbeit verwendete Aptamer als selektiv für L. monocytogenes29. Dieses Aptamer zielt auf das Oberflächenprotein Internalin A ab, das eines der wichtigsten Invasionsproteine ​​ist, die an der Pathogenese beteiligt sind29. Obwohl dieses Protein strukturell mit bestimmten Zellwandproteinen mit internen Wiederholungen vergleichbar ist, die bei Mitgliedern der Gattungen Staphylococcus und Streptococcus65 identifiziert wurden, bestätigen die vorliegenden Ergebnisse, dass dieses Aptamer selektiv für L. monocytogenes sein kann.

Repräsentative Bode-Diagramme über den Frequenzbereich von 1–100.000 Hz (Einschübe sind im Hinblick auf den unteren Frequenzbereich von 1 bis 5 Hz vergrößert) für den ALG-Thiomer/Pt-Bürstensensor, funktionalisiert mit 400 nM Aptamer, exponiert mit (a) L .monocytogenes in PBS und (b) L. monocytogenes + S. aureus in PBS. (c) Kalibrierungskurven (Gesamtimpedanzänderung bei 1 Hz vs. logarithmische Bakterienkonzentration). Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des arithmetischen Mittels von mindestens drei Wiederholungen dar.

Nachdem die Fähigkeit des ALG-Thiomer/Pt-Bürstensensors zum Nachweis von Bakterien in PBS bestätigt wurde, wurden die Sensoren in einem Lebensmittelprodukt getestet, um ihre Selektivität für die Zielbakterien zu bestimmen und um festzustellen, ob die Empfindlichkeit durch die Beeinträchtigung durch Lebensmittelbestandteile beeinträchtigt werden könnte. Hühnerbrühe (Abb. 6, y = 42,59x + 1320,93, R2 = 0,98) wurde verwendet, da sie neben anderen Komponenten Kohlenhydrate und Proteine ​​enthält, die durch unspezifische Adsorption mit dem Biosensor interagieren könnten, was zu einem falsch positiven Signal führen könnte. Die Empfindlichkeit gegenüber L. monocytogenes in Hühnerbrühe betrug 42,59 ± 2,35 Ω/log(KBE ml–1) mit einer LOD von 4,4 ± 0,8 KBE ml–1, beides ähnlich (p > 0,05) wie die Ergebnisse in PBS. Diese Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass das Aptamer auch in komplexen Lebensmittelmatrizen selektiv an L. monocytogenes binden kann. Unter Verwendung des gleichen Aptamers berichteten Hills et al.30 über einen etwas höheren LOD von 9,1 KBE mL−1 in Gemüsebrühe mit einer schichtweise reduzierten Graphenoxid/Nanoplatin/Chitosan-Bürstenelektrode, die auf der Grundlage der pH-Reaktion des Chitosans aktiviert wurde.

(a) Repräsentatives Bode-Diagramm über den Frequenzbereich von 1–100.000 Hz (Einschübe sind im Hinblick auf den unteren Frequenzbereich von 1 bis 5 Hz vergrößert) und (b) Kalibrierungskurve (Gesamtimpedanzänderung bei 1 Hz vs. logarithmische Bakterien). Konzentration) für den ALG-Thiomer/Pt-Bürstensensor, funktionalisiert mit 400 nM Aptamer, ausgesetzt gegenüber L. monocytogenes in Hühnerbrühe. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des arithmetischen Mittels von mindestens drei Wiederholungen dar.

Die Bindungswirksamkeit des Aptamers und seine Rolle auf die Biosensorleistung wurden weiter bewertet, indem der ALG-Thiomer/Pt-Bürstensensor ohne Aptamere steigenden Konzentrationen von L. monocytogenes in PBS ausgesetzt wurde (siehe Hintergrundinformationen, Abb. S4). Der erhaltene LOD betrug 28,88 ± 1,31 KBE mL-1 mit einer Empfindlichkeit von jeweils 23,27 ± 7,87 Ω/log(KBE mL-1). Die Leistungen des zuvor vorgestellten Sensors mit Aptamer waren deutlich (p < 0,05) besser im Vergleich zu dem Sensor ohne Aptamer. Trotz einiger zufälliger Einschlüsse von Bakterien auf den Nanobürsten belegen diese LOD- und Empfindlichkeitsergebnisse die Rolle des Aptamers bei der selektiven Bindung an L. monocytogenes und der deutlichen Verbesserung der Leistung des Sensors. Darüber hinaus belegen diese Ergebnisse die Wirksamkeit des Betätigungsprotokolls beim Einfangen von Bakterien mithilfe der ALG-Thiomer/Pt-Bürsten, was als erster Schritt zur Überwachung der Lebensmittelsicherheit (d. h. Gesamtbakterienzahl) verwendet werden könnte.

Alginat wird aufgrund seiner Biokompatibilität und funktionellen Gruppen, die für die Einkapselung und Immobilisierung von Bioerkennungswirkstoffen nützlich sind, unter anderem für den Nachweis von Antibiotika, Tumorzellen und Blutanalysen, immer beliebter für Biosensoranwendungen66,67. Einige verwendeten eingekapselte Bakterien zur Überwachung der Wassertoxizität68,69, aber immer noch weniger Berichte beinhalten den Nachweis von Bakterien. Beispielsweise verwendeten Kikuchi et al.70 Alginat, um einen Farbstoff einzukapseln, der durch das b-Galactosidase-Enzym aus E. coli für seinen Nachweis in der Muttermilch abgespalten wird, und berichteten über einen LOD von 102 KBE ml−1 nach 2 bis 8 Stunden Inkubation.

Eine Zusammenstellung aktueller Biosensoren zum Nachweis von L. monocytogenes in verschiedenen Lebensmittelproben oder Puffern ist in Tabelle S1 dargestellt (siehe Hintergrundinformationen). Liu et al.71 präsentierten gute Ergebnisse beim Nachweis von L. monocytogenes in einem Bereich von 68 bis 68 × 106 KBE ml-1 unter Verwendung von Aptamer-funktionalisierten magnetischen Nanopartikeln (als Vorkonzentrationssonden) und Aptamer-funktionalisierten Upconversion-Nanopartikeln (Fluoreszenzsignalsonden). zusammen; Das Verfahren umfasst jedoch eine einstündige Inkubation plus einen Vorkonzentrationsschritt. Sidhu et al.72 schlugen eine ineinandergreifende Anordnung von Platin-Mikroelektroden vor, die mit demselben Aptamer funktionalisiert waren, das in der vorliegenden Arbeit verwendet wurde, und berichteten über einen LOD von 5,39 KBE mL−1 Listeria spp. in PBS auch mit 17-minütiger Detektion. In einer anderen Arbeit verwendeten Sidhu et al.32 die gleichen interdigital angeordneten Platin-Mikroelektroden, die mit Aptameren funktionalisiert waren, um einen schnellen Vor-Ort-Fluss durch den Nachweis von Listeria spp. zu ermöglichen. in Bewässerungswasser unter Verwendung eines Smartphone-basierten Potentiostats und unter Strömungsbedingungen und der gemeldete LOD betrug 48 CFU mL-1. Unser Sensor bietet einige Vorteile gegenüber den meisten in der Literatur genannten, darunter eine einfachere und schnellere Herstellung, ohne dass eine Reinraumfertigung erforderlich ist; keine Kennzeichnung oder Vorkonzentration der Bakterien erforderlich; und kurze Nachweiszeit, was zu den bislang effizientesten Plattformen für die L. monocytogenes-Erkennung zählt, mit niedriger Nachweisgrenze und großem linearen Erfassungsbereich, der für die Lebensmittelsicherheit relevant ist.

Der Nachweis eines bestimmten Krankheitserregers in einer echten Lebensmittelprobe ist zeitaufwändig und mühsam, da es aufgrund von Verunreinigungen in der Probe Hintergrundsignale gibt, die entweder auf die komplexen Mehrkomponentenstrukturen oder das Vorhandensein anderer Mikroorganismen (pathogen und nicht pathogen) zurückzuführen sind, was eine vorherige Analyse erfordert. Anreicherungsbehandlungen und Laborumgebungen. Diese Studie berichtet über einen empfindlichen, selektiven und einfach herzustellenden impedimetrischen Aptasensor unter Verwendung eines einstufigen Herstellungsprozesses von Alginat-Thiomer/Platin-Nanobürsten. Zum ersten Mal zeigen wir, dass mit Nanoplatin und Aptameren modifiziertes ALG-Thiomer die stimuliresponsiven Eigenschaften des Alginats beibehält und gleichzeitig aufgrund der Aptamerbindung auch die Affinität für Zielbakterien, L. monocytogenes, beibehält. Die Betätigung der ALG-Thiomer/Pt-Bürsten verbesserte die Bakterienerkennung aufgrund des Einschlusses der Matrix im kollabierten Zustand deutlich. Der lineare Erfassungsbereich zwischen 10 und 106 KBE ml-1 und die Nachweisgrenze von 5 KBE ml-1 in einer Lebensmittelprobe decken die relevanten Werte für die Lebensmittelsicherheitsanalyse ab und ermöglichen es Lebensmittelherstellern, die wirtschaftlichen und öffentlichen Auswirkungen von Rückrufen kontaminierter Lebensmittel zu reduzieren . Im Vergleich zu anderen in der Literatur verfügbaren Methoden gehört dieser Sensor zu den effizientesten Einfangmechanismen für L. monocytogenes und bietet darüber hinaus weitere Vorteile wie die einfache Herstellung in einem Schritt, keine Markierung, keine Vorinkubation oder Konzentration erforderlich und eine Reaktion Zeit von 17 Min. Die in dieser Studie präsentierten Ergebnisse zeigen, dass die entwickelte Sensorplattform für den Einsatz in Anwendungen zur Überwachung der Lebensmittelsicherheit geeignet ist. Darüber hinaus kann diese ALG-Thiomer-Plattform weiter auf die Erkennung anderer lebensmittelbedingter Krankheitserreger oder kleiner Moleküle getestet werden, wodurch die Erkennung von Zielen in komplexen Matrizen erheblich vorangetrieben wird.

Die in dieser Studie präsentierten Daten sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Wir danken dem National Institute of Food and Agriculture des US-Landwirtschaftsministeriums für die finanzielle Unterstützung mit den Auszeichnungsnummern 2020-67021-31375, 2020-67017-33079 und 2018-67016-27578 als Center of Excellence. Die National Science Foundation unter der Auszeichnungsnummer CBET-1805512. Abbildung 1 wurde mit BioRender erstellt.

Abteilung für Bio- und Agrartechnik, Texas A&M University, College Station, TX, 77843, USA

Daniela A. Oliveira

Agrarwissenschaften, Clemson University, Clemson, SC, 29631, USA

Eric S. McLamore

Fakultät für Maschinenbau, Iowa State University, Ames, IA, 50011, USA

Carmen L. Gomes

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Das Manuskript wurde durch Beiträge aller Autoren verfasst. Alle Autoren haben der endgültigen Fassung des Manuskripts zugestimmt. Konzeptualisierung, ESM und CLG; Methodik, DAO, ESM und CLG; Validierung, DAO, CLG; formale Analyse, DAO, ESM und CLG; Ressourcen, ESM und CLG; Datenkuration, DAO, ESM und CLG; Erstellung von schriftlichen Originalentwürfen, DAO; Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten, DAO, ESM und CLG; Visualisierung, DAO, ESM und CLG; Aufsicht, ESM und CLG; Finanzierungseinwerbung, ESM und CLG

Korrespondenz mit Carmen L. Gomes.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 13. Mai 2022

Angenommen: 05. Dezember 2022

Veröffentlicht: 10. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25753-7

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